基于酰基载体蛋白的蛋白标记方法技术

本文公开了用各种不同的标记物标记酰基载体蛋白（ＡＣＰ）融和蛋白的方法。该方法的原理是用酰基载体蛋白合酶（ＡＣＰＳ）全酶或是它的同源物将标记物从辅酶Ａ（ＣｏＡ）型底物转移到融合蛋白上。本方法通过将分子连接在融合蛋白上，给融合蛋白带来新的物理或化学性质，从而可以在体内或体外检测和操纵融合蛋白。这类标记物的实例中包括光谱探针或报道分子、亲和标签、产生活性自由基的分子、交联物、介导蛋白蛋白相互作用的配体或适于固定融合蛋白的分子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及将标记从底物转移到包含目的蛋白和酰基载体蛋白或其片段的融合蛋白上的方法，特别是进一步包括检测组分和/或操纵被标记的融合蛋白的方法。
技术介绍
对复杂生物系统理解的过程依赖于特性描述生物分子特别是蛋白质分子间潜在的相互作用。虽然通过对越来越多种生物的DNA测序鉴别了它们的开放阅读框(ORF)，但是在体内和体外对相应蛋白性质的鉴定的可能性仍是有限的。绝大多数致力于实现这一目标的策略基于构建一个融合蛋白，这个融合蛋白不仅可以纯化以在体外应用，也可以进一步在体内应用。这类标签的实例包括6×His标签、S-谷胱甘肽转移酶、麦芽糖结合蛋白、抗原决定簇标签、酵母双杂交系统、O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶、断裂-泛素和绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白。但是，这些巯基乙胺(P-pant)连接到apo-ACP保守的丝氨酸残基上，得到了完整酰基载体蛋白(holo-ACP)。磷酸泛酰巯基乙胺来源于辅酶A。Gehring等人(1997)进一步证实使用在泛酰巯基乙胺部位被修饰但仍可作为ACPS底物的辅酶A类似物，可获得具有修饰的P-pant的holo-ACP。在国际专利申请WO 97/13845中对分离的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶如ACPS进行了描述。在国际专利申请WO 02/083937中描述了将一个标记物转移到O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)融合蛋白上的方法，以及这种方法在检测AGT融合蛋白中的应用。专利技术概要本专利技术涉及一种检测和/或操纵目的蛋白的方法，内容包括用被标记的辅酶A(CoA)型底物以及酰基载体蛋白合酶(ACPS)全酶或是它的同源物接触融合蛋白，使ACPS将标记物转移到融合蛋白上，此融合蛋白包含目的蛋白、酰基载体蛋白(ACP)或者该载体一个片段；以及任选在以识别/运用标记物为目的而设计的系统中，利用该标记物检测和/或进一步操纵所得的标记融合蛋白。此外，本专利技术还涉及包含了目的蛋白和ACP或其片段的融合蛋白的应用。特别是，利用本专利技术方法连接上的标记物可用来在体内或体外对目的蛋白进行纯化、固定或是持续监测。任何种类的蛋白都可用本专利技术方法来构建融合蛋白，包括蛋白质分子、多肽、还是任意长度的肽链，不管有无二级、三级和四级结构。本专利技术中独特的被标记辅酶A(CoA)型底物是从辅酶A或者修饰的辅酶A获得的，通过一个接头连接到该辅酶A上，这个接头至少含有一个反应位点，用以进一步连接标记，即一个可检测的标记。本专利技术也涉及这些新颖的标记辅酶A(CoA)型底物，制备这些底物的方法，和在合成这些底物过程中有用的中间体，以及这些底物在本专利技术中的应用。附图简述附图说明图1(A)6×His-ACP(1μM)，6×His-ACPS(0.2μM)和CoA-Bt(5μM)反应分析。按照所指示的时间(t)，从反应混合物中取出等份试样，使用链霉亲和素-过氧化物酶缀合物，通过Western blotting来探测6×His-ACP的生物素酰化反应。(B)6×His-ACP的生物素酰化过程的定量6×His-ACP(3μM)，6×His-ACPS(5μM)和CoA-Bt(10μM)一起温育30min，透析，然后等份样品与链霉亲和素一起温育，将样品上SDS-PAGE(第二泳道)。稳定的生物素-链霉亲和素缀合物的生成会引起生物素酰化蛋白在凝胶中的移动。通过比较第一泳道含等浓度6×His-ACP但没有链霉亲和素的带和第二泳道6×His-ACP的带亮度，来评价生物素酰化反应的量。(C)作为ACPS底物的CoA和CoA-Bt(或CoA-Dg)间的竞争性实验6×His-ACP(0.4μM)，6×His-ACPS(0.4μM)，CoA-Bt或CoA-Dg(2μM)和不同浓度的CoA(0-80μM)一起温育30min，标记反应的程度用Western blotting来测定。Western blots中相关信号强度(I)，负相关于/值(L＝标记物)，并与方程式I＝A/(1+Bx)拟合，这里x代表/，A是一个非特定常数，B是(Kcat/KM)CoA/(Kcat/KM)CoA-L。这些实验得到了特定常数为0.48时(Kcat/KM)CoA/(Kcat/KM)CoA-Bt的比值和常数为0.35时(Kcat/KM)CoA/(Kcat/KM)CoA-Dg的比值，揭示了游离CoA和CoA衍生物没有显著差异。图2(A-F)是在酵母细胞表面标记ACP融合蛋白。荧光显微照片(A)是表达了Cy3标记Aga2-ACP的酵母细胞，(D)是用链霉亲和素包被的量子点标记的表达了生物素标记酵母细胞。(B)类似于(A)，(E)类似于(D)，但是细胞不表达Aga2-ACP蛋白。(C)和(F)分别是(B)和(D)相同样品的透射显微照片。这些实验表明只有那些表达Aga2-ACP蛋白的酵母细胞才能被标记。专利技术详述本专利技术涉及一种检测和/或操纵目的蛋白的方法，内容包括用被标记的辅酶A(CoA)型底物以及酰基载体蛋白合酶(ACPS)全酶或是它的同源物接触融合蛋白，使ACPS将标记物转移到融合蛋白上，此融合蛋白包含目的蛋白、酰基载体蛋白(ACP)或者该载体一个片段；以及任选在以识别/运用标记物为目的而设计的系统中，利用该标记物检测和/或进一步操纵所得的标记融合蛋白。ACP或ACP的结构域蛋白在脂肪酸、聚酮化合物和非核糖体多肽的生物合成中作为载体。酰基载体蛋白合酶(ACPS)全酶对ACP进行翻译后修饰，将辅因子4′-磷酸泛酰巯基乙胺从辅酶A转移到ACP的一个保守丝氨酸残基上。ACPS也被称为磷酸泛酰巯基乙胺转移酶。在对CoA的磷酸泛酰巯基乙胺部分中硫醇基进行修饰时，ACPS表现出相对低的底物特异性。利用这一点，将ACP融合蛋白与ACPS和通过其磷酸泛酰巯基乙胺部分携带标记物的CoA衍生物一起温育，ACP融合蛋白即被特异性标记。由此，这个标记物通过磷酸泛酰巯基乙胺部分传递到ACP的保守丝氨酸残基上。这个标记过程不依赖于融合蛋白的性质。这里ACPS和ACP的概念代表了任意一对蛋白分子，其中之一(ACP)是磷酸泛酰巯基乙胺衍生物基团的受体，这个磷酸泛酰巯基乙胺衍生物基团来源于CoA衍生物，另一个(ACPS)催化磷酸泛酰巯基乙胺衍生物转运到这个ACP上。在这里术语ACPS和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶可以互相交换使用，尽管有以下事实很多与大肠杆菌ACPS同源的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶所修饰的蛋白并不参与脂肪酸的合成，而参与天然产物的生物合成(Lambalot等，1996)。这种磷酸泛酰巯基乙胺转移酶诸如EntD，参与肠杆菌素的合成；Sfp和Psf-1，参与枯草菌脂肽的生物合成；Gsp，参与短杆菌肽S的生物合成；LYS5，参与赖氨酸的生物合成；Bli，参与杆菌肽的合成；Lpa-14，参与伊枯草菌素A的生物合成；以及NshC，参与诺雪七肽的生物合成。此专利技术包括了所有与大肠杆菌来源的ACPS同源的泛酰巯基乙胺转移酶在标记蛋白方面的应用。术语ACP代表任意一种蛋白，这种蛋白可以被大肠杆菌ACPS催化或者被依据Lambalot等人(1996)定义的任何与大肠杆菌ACPS同源的ACPS催化，进行翻译后的磷酸泛酰巯基乙胺修饰。这不仅包括参与脂肪酸合成的蛋白，也包括参与聚酮合成，非核糖体多肽合成，氨基酸合成以及缩酚酸肽合成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测和／或操纵目的蛋白的方法，所述方法包括使包含目的蛋白和酰基载体蛋白（ＡＣＰ）或其片段的融合蛋白与被标记的辅酶Ａ（ＣｏＡ）型底物和酰基载体蛋白合酶（ＡＣＰＳ）全酶或其同源物接触以使ＡＣＰＳ将标记物转移到融合蛋白上，并在以检测和／或操纵所述标记物为目的而设计的系统中，利用该标记物检测和／或进一步操纵所得的标记融合蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：K约翰森，N乔治，
申请(专利权)人：瑞士联邦理工大学洛桑EPFL，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]