猪、牛口蹄疫病毒非结构蛋白酶联免疫吸附试验检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及口蹄疫病毒非结构蛋白３ＡＢ在大肠杆菌表达系统中的克隆和表达，及其表达产物在口蹄疫注苗与感染动物的鉴别诊断方面的应用。利用本发明专利技术的检测试剂盒，可高效、特异性地对口蹄疫易感动物猪、牛等作感染与免疫抗体的鉴别诊断。本发明专利技术试剂盒特异性强，使用方便，价格低廉。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，更具体地涉及口蹄疫病毒非结构蛋白3AB在大肠杆菌表达系统中的克隆和表达，及其表达产物与其它相关试剂组成的试剂盒在口蹄疫注苗与感染动物的鉴别诊断方面的应用。
技术介绍
口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是家畜和野生偶蹄动物的烈性传染病。一旦爆发则迅速传播，可引起大范围的易感动物感染发病，造成巨大的经济损失。自从Burrows(1966年)和Van Bekkum(1966年)等从临床健康牛的食道-咽部分泌物(O-P液)中分离出口蹄疫病毒以来，口蹄疫康复动物隐性带毒，可能成为口蹄疫爆发的潜在疫源的问题引起了世界各国的高度重视，并相继进行了大量研究。鉴于我国防制口蹄疫的主要措施是实行免疫接种，对牛、羊、猪等易感畜群每年定期注苗2-3次。因此，建立准确、快捷的区分感染活病毒(发病或注射弱毒疫苗)和注射灭活疫苗动物的诊断方法在检测和防制FMD的发生、活畜检疫等方面都是十分必要和迫切需要的。近年来，英、美、荷兰等国学者对口蹄疫病毒的非结构蛋白(NSP-)2C、3A、3B、3ABC等片段作了大量细致的研究，建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)，适用于鉴别诊断感染和注苗动物。本研究采用DNA重组技术，在大肠杆菌中表达口蹄疫非结构蛋白3AB，并以此重组蛋白作为检测抗原和阳性对照血清制备用抗原，制备ELISA检测试剂盒，用于猪/牛口蹄疫非结构蛋白抗体的检测，由检测结果判定被检动物是否感染口蹄疫病毒。现已完成上万头份中试生产和推广，应用结果证明，试剂盒是有效的，可用于口蹄疫注苗与感染动物的鉴别诊断。本项目所研制的试剂盒被用于口蹄疫易感动物猪/牛的注苗与感染抗体的鉴别诊断，为我国防制并最终消灭口蹄疫提供技术保障，减少、甚至减除畜牧业生产因口蹄疫所带来的损失。同时，该项技术的使用，将全面提升我国畜牧业生产及加工产品的国际地位，加速我国畜牧业产品走向国际市场的进度。另外，本项目所研制的试剂盒可望替代进口同类产品，为国家节省大量外汇，更重要的是一旦我们拥有自主知识产权，可使我国的口蹄疫诊断检疫技术达到世界先进水平。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种新的用于鉴别诊断口蹄疫注苗与感染动物的技术和相关试剂盒。附图说明图1显示了3AB基因RT-PCR扩增结果及重组载体pET3AB的双酶切结果。其中各泳道是3AB的RT-PCR扩增产物(泳道4)，用BamH I和Hind III消化的pET3ABC(泳道2)，DNA标准物DL15000(泳道1，Takara公司)，DNA标准物DL2000(泳道3，Takara公司)。图2显示了rNS-3AB融合蛋白IPTG诱导表达SDS-PAGE电泳(12％)，目的蛋白rNS-3AB纯化结果SDS-PAGE电泳(12％)，及免疫印迹反应结果。其中各泳道是PET3AB未诱导(泳道1)，PET3AB IPTG诱导(泳道2，3，4，6)，蛋白分子量标准(泳道5，7，Biolabs)，PET3ABC表达产物纯化结果(泳道8，9，10)，Western印迹结果(泳道12)，一抗是FMDV感染的牛血清，二抗是偶联有辣根过氧化物酶的蛋白A/G(Pierce公司)，预染的蛋白质梯级标准物(泳道11，Gibco BRL公司)。具体实施例方式本专利技术人经过多年深入而广泛的研究，已经成功构建了表达口蹄疫病毒非结构蛋白3AB的表达载体，该载体经转化大肠杆菌后，可得到表达3AB蛋白的重组表达菌株，且表达的目的蛋白rNS-3AB对宿主细胞无毒害，不影响细菌的正常繁殖。对表达的目的蛋白rNS-3AB经变性、纯化、复性处理后，得到的最终产物作为检测抗原，建立间接酶联免疫吸附法(I-ELISA)对口蹄疫感染与注苗动物进行鉴别诊断试验，已有的试验结果显示，本专利技术所获得的rNS-3AB蛋白可作为口蹄疫注苗与感染动物鉴别诊断的有效的、高特异性的检测抗原。在此基础上完成了本专利技术。本专利技术的检测试剂盒，可对口蹄疫易感动物猪、牛等作鉴别诊断。该试剂盒特异性强，使用方便，价格低廉。下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1口蹄疫病毒非结构蛋白3AB表达和纯化1.口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因序列的扩增用上海生工试剂盒从细胞培养的猪、牛口蹄疫病毒中提取总RNA，操作步骤按试剂盒说明书进行。以提取得到的总RNA为模板，进行反转录PCR，反转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，产品名Reverse Transcriptase XL(AMV)。cDNA第一条链的合成引物为Oligo(dT)，目标cDNA的合成，引物由上海生工合成，引物序列5’端引物5’-GGATCCATCTCAATTCCTTCTC-3’，3’端引物5’-AAGCTTCTCAGTGACAATCAGG-3’，设计引物时分别在5’端和3’端引入BamH I及Hind III酶切位点。PCR扩增按常规方法进行，1％Agarose凝胶电泳，观察结果。同时PCR产物送上海生工生物技术公司测序。结果，以口蹄疫病毒基因组RNA为模板，RT-PCR扩增得到了3ABC DNA序列(图1)，序列长度约0.66kb，与文献报道长度一致。2 pET3AB表达质粒的构建2.1 T-3AB重组质粒的构建3AB PCR扩增片段经1％低融点Agrose凝胶纯化后，与T载体连接。T载体购自上海生工生物技术服务有限公司，产品名T-Vector PCR Product ClongingKit，连接酶为大连宝生物工程有限公司产品，产品名DNA Ligation Kit Ver.2。重组质粒T-3AB转化DH5α宿主菌。抽提质粒(上海生工UNIQ-10柱离心式质粒抽提试剂盒)，BamH I/Hind III双酶切鉴定，同时进行测序(由上海生工测序部完成)。结果，得到重组了T-3AB质粒，BamH I、Hind III双酶切鉴定确认重组载体中包含3AB片段。2.2 pET3AB表达质粒的构建载体pET32a及宿主菌BL21(DE3)plysS均购自Novagen公司。重组T-3AB质粒和载体pET32a分别用BamH I、Hind III双酶切，酶切产物3AB片段及载体pET32a酶切大片段经1％低融点Agrose凝胶纯化后连接，得到重组质粒pET3AB，转化宿主菌BL21(DE3)plysS，涂布含氨卞青霉素的LB平板，得到重组克隆菌落PET3AB。从重组菌落中提取质粒，BamH I/Hind III双酶切，1％ Agrose凝胶电泳鉴定，同时，由上海申友生物技术有限公司测序。质粒酶切结果如图1所示。对测序结果进行计算机分析，表明重组3ABC序列与文献报道序列符合率大于90％，插入位置阅读框正确。3.目的蛋白3AB的表达克隆菌落在含100μg/mL氨苄青霉素的LB发酵液中培养，待OD值达到0.5左右时，加入IPTG诱导，IPTG浓度为1mmol/L，诱导时间3-4h，收本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白，其特征在于，它包含３所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：尤永进，潘洁，陈波，徐泉兴，饶忠，
申请(专利权)人：上海市农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]