抗胆碱能M3型受体抗体测定在干燥综合征诊断中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种胆碱能Ｍ３型受体及其类似物用于干燥综合征的检测。这种蛋白可特异性的结合干燥综合征患者体内的特异性抗体，具有很高的敏感性和特异性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗抗胆碱能M3型受体抗体作为抗原在检测干燥综合征及其它疾病中的应用。一、技术背景干燥综合征(Sjgren’s Syndrome，SS)是一种以侵及泪腺和唾液腺等外分泌腺为特征的全身性自身免疫疾病。该病最常见的临床表现为眼干、口干，并可累及肺、肾脏、淋巴系统、血管及肝脏等器官。此病无明显的地区分布差异，可发生于任何年龄，以40-60岁，特别是绝经后的女性居多，男女之比为1∶9。在我国的患病率为0.77％，在老年人群中的患病率高达4％，全国有近1000万患者。近年来，人们对干燥综合征的病因及发病机理进行了大量研究，但至今无突破性进展。目前在临床上尚未发现理想的血清学诊断方法，除临床症状外，主要靠唇腺活检及腮腺造影等有创检查明确诊断，由于患者的医从性差，常常延误诊断，并丧失最佳的治疗时机。因此，寻找一种敏感性强、特异性高而又简便易行的检测方法，对干燥综合征的诊断及治疗具有重要意义。为此，本专利技术人经过多年研究发现了可以用于干燥综合征诊断的血清学特异性抗原——抗胆碱能M3型受体，该蛋白可以特异性的识别干燥综合征患者血清中的特异性抗体——抗胆碱能M3型受体抗体，该抗体可通过一些较为简便的免疫学检测方法(如免疫印迹法)检测出来，并且具有很高的敏感性和特异性。二、专利技术概述本专利技术目的是提供有效检测干燥综合征特异性抗原的检测方法，并应用于干燥综合征的诊断。胆碱能M3型受体是一种主要分布于外分泌腺及平滑肌的胆碱能受体，也是一种G-蛋白偶联受体。它结合胆碱能神经释放的神经递质——乙酰胆碱，激活磷脂酶C、A2、D通路，电压依赖性钙通道开放，使钙内流增加，细胞内钙的浓度升高，cAMP增加，引起腺体分泌和平滑肌收缩。近年来的研究发现SS患者血清中的抗胆碱能M3型受体抗体可以识别并激活M3型受体，该抗体与M3型受体的长期结合，不仅降低胆碱能M3型受体对乙酰胆碱的敏感性，还造成M3型受体的进行性破坏，导致受体的降解，进而影响信号传导通路、干扰水通道蛋白的分布，致使SS患者出现腺体分泌减少、膀胱逼尿肌收缩力减弱等胆碱能神经功能异常的临床表现。1996年，Bacman等报道了SS患者血清中存在着抗胆碱能M3型受体抗体，并进一步指出该抗体对于SS的诊断具有较高的特异性。但是至今为止，国内尚没有开展抗胆碱能M3型受体抗体与干燥综合征关系的研究，国外也没有这方面大样本的临床研究，而且国内、外都没有建立切实可行的该抗体的临床检测方法。以往人们认为胆碱能M3型受体的抗原表位位于其细胞外第二环，但是，发现使用M3型受体细胞外第二环多肽检测SS患者血清中抗胆碱能M3型受体抗体方法的重复性不佳。一些研究提出胆碱能M3型受体可能为构象型抗原表位，因而提示抗胆碱能M3型受体抗体很可能识别的是M3型受体蛋白质的空间结构。因而本研究选择真核表达的重组胆碱能M3型受体蛋白作为抗原基质，通过免疫印迹(Western Blot)的方法检测SS患者血清中的抗胆碱能M3型受体抗体。该蛋白是一种用于检测受体与配体结合能力的蛋白，本研究在国内外首次证实该蛋白可以用于检测抗胆碱能M3型受体抗体。并评价该抗体对SS诊断的敏感性和特异性，了解该抗体与SS临床表现及其它自身抗体的关系。本专利技术的抗胆碱能M3型受体抗体可以通过多种方法(例如免疫印迹法、斑点法、酶联免疫吸附法、金标记法等)对干燥综合征患者进行检测，其检测方法为本领域技术人员所熟知。同时，检测的抗胆碱能M3型受体抗体类型可为IgG型、IgA型或其他类型的免疫球蛋白。本专利技术所述的胆碱能M3型受体可以用本领域人员所熟知得方法得到，例如固相合成法、基因工程表达纯化法等。 附图说明图1.免疫印记法检测原理。首先将胆碱能M3型受体进行Tris-HCL SDS-PAGE，然后将其转移到硝酸纤维膜上，脱脂牛奶封闭过夜。将其与待测血清一起孵育，如果血清中存在抗胆碱能M3型受体抗体，该抗体就会与硝酸纤维膜上的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。将未结合的抗体及其它成份冲洗去除后，与生物素标记的山羊抗人IgG共同孵育。再洗去未结合的成份，加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素一起温育。洗去未结合的成份，加入二氨基联苯胺(DAB)显色。若血清中含有抗胆碱能M3型受体抗体，在硝酸纤维膜上抗原所在特定位置上显示出颜色，且抗体滴度越高颜色越深。图2.重组胆碱能M3型受体蛋白电泳。蛋白纯度为95％。10％ Tris-HCL SDS-PAGE，考马斯亮兰R250染色。显示分子量为70kD的重组胆碱能M3型受体蛋白。图3.免疫印迹法(Western Blot)检测抗胆碱能M3型受体抗体。检测结果显示已知的抗胆碱能M3型受体的多抗与重组胆碱能M3型受体蛋白发生了特定的抗原抗体反应，出现特异性阳性条带(A)；而阴性对照则无该条带(B)。图4.抗胆碱能M3型受体抗体与SS患者血清及对照组血清反应。结果显示山羊抗人抗胆碱能M3型受体多抗(膜条1)与抗胆碱能M3型受体反应呈阳性；干燥综合征患者(膜条2-12)血清与重组胆碱能M3型受体蛋白发生抗原抗体反应，出现阳性条带；而疾病对照组(条带13)及正常对照(条带14)组与该蛋白无反应，无条带。图5.抗胆碱能M3型受体抗体在不同风湿性疾病的阳性率。应用免疫印迹法检测80例SS患者，其中67例抗胆碱能M3型受体抗体阳性，阳性率为83.8％；在40例类风湿关节炎(RA)患者中无阳性出现；在40例系统性红斑狼疮(SLE)患者中仅2例阳性，阳性率为5％；40名正常对照组中，有1例阳性。SS组抗胆碱能M3型受体抗体阳性率与疾病对照组及正常对照组比较差异有显著性(P＜0.01)。抗胆碱能M3型受体抗体在SS患者的敏感性为83.8％，特异性为97.5％。图6.抗胆碱能M3型受体抗体与其他自身抗体敏感性及特异性比较。在80例SS患者中对各种抗体的比较可以看出，抗胆碱能M3型受体抗体的敏感性高于抗SSA、SSB及抗α-胞衬蛋白抗体，差异有统计学意义(p＜0.01)；抗胆碱能M3型受体抗体在诊断SS的特异性方面，优于抗SSA和抗SSB，差异有统计学意义(P＜0.01；P＜0.05)；抗胆碱能M3型受体抗体的特异性高于抗α-胞衬蛋白抗体，差异无统计学意义(P＞0.05)。图7.抗胆碱能M3型受体抗体在其他抗体阴性的SS患者的阳性率。在抗SSA、SSB、抗α-胞衬蛋白抗体阴性的SS患者中，72％-81％出现抗胆碱能M3型受体抗体阳性。特别是在抗SSA抗体阴性的SS患者中，抗胆碱能M3型受体抗体的阳性率达80.0％，对SS的诊断中更有意义。图8.抗胆碱能M3型受体抗体在其他抗体阳性的SS患者的阳性率。在抗SSA、SSB、抗α-胞衬蛋白抗体阳性的SS患者中，出现抗胆碱能M3型受体抗体阳性率分别为87.5％、88.2％、85.4％。以下通过实施例进一步说明本专利技术，但下列实施例不以任何方式限制本专利技术的范围。实施例实施例1胆碱能M3型受体的鉴定胆碱能M3型受体是一种主要分布于外分泌腺及平滑肌的胆碱能受体，也是一种G-蛋白偶联受体。近年来的研究发现SS患者血清中的抗胆碱能M3型受体抗体可以识别并激活M3型受体。以往人们认为胆碱能M3型受体的抗原表位位于其细胞外第二环，但是，发现使用M3型受体细胞外第二环多肽检测SS患者血清中抗胆碱本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有胆碱能Ｍ３型受体的氨基酸、多肽类似物及蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：栗占国，
申请(专利权)人：北京大学人民医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]