一种大规模发酵铁蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种大规模发酵铁蛋白的方法。所述方法包括使用不含微量元素的发酵培养基，并优化了发酵条件。本发明专利技术的方法发酵效率高、成本低、制备的铁蛋白载药效果好、质量均一稳定。

【技术实现步骤摘要】
一种大规模发酵铁蛋白的方法
本专利技术涉及生物医学工程
，具体涉及一种大规模发酵铁蛋白的方法。
技术介绍
铁蛋白是一类广泛存在于动物、植物及微生物中的天然铁贮存蛋白。在人体或其他哺乳动物体内分离的铁蛋白通常由两种不同的铁蛋白亚基（H亚基和L亚基）构成，H亚基和L亚基的分子质量分别为21kDa和19kDa。典型的铁蛋白结构是由24个H亚基/L亚基自组装形成的笼状结构，外径12nm，内部形成直径8nm的内腔结构。笼状结构容纳包含多达4500个铁原子的铁核。由于铁蛋白其具有可包裹药物的笼状结构、显著的稳定性、较小且均一的尺寸，本领域已经尝试将铁蛋白用作药物载体以递送药物，例如可见Ferritin-baseddrugdeliverysystems:Hybridnanocarriersforvascularimmunotargeting,MakanKhoshnejadet.al,JournalofControlledRelease282(2018)13-24。WO2015180325A1描述了由重组方法制备获得的仅由H亚基自组装成的铁蛋白(HFn)，由于其能够与受体TfR1结合而靶向肿瘤细胞，从而可以用作肿瘤特异性给药的药物载体。WO2018153372A1则教导了HFn可用作能够穿越血脑屏障的纳米药物载体。此外，重组铁蛋白还可作为医学成像、延长活性药物半衰期、诊断检测等用途。与其他纳米药物载体相比，铁蛋白由于来自生物体内，是一种天然存在的蛋白质，不具备免疫原性，且其空腔内载药量大，加上HFn的主动肿瘤靶向性，因此具有广阔的作为药物递送载体的应用前景。采用基因工程方法可以获得重组的铁蛋白。但是，目前通过重组技术制备铁蛋白的方法多处于实验室或小试阶段，缺乏大规模发酵培养的成熟工艺。如中国专利申请CN101921798A公开了一种基因重组人铁蛋白轻链的制备方法，该专利申请使用LB培养基进行摇瓶培养，是实验室规模的小量培养方式，发酵效率低，该发酵方法不适合包载药物，不适用于大规模发酵培养。CN104017089A公开了一种HFn纳米粒子的制备方法和用途，其同样是采用LB培养基摇瓶小规模培养，且其重点在于铁蛋白亚基的复性而非发酵工艺的研究。另外，由于发酵过程中一系列因素的影响，使得制备的铁蛋白纯化难度大，费用高，导致载药量低、杂质多、稳定性差等问题。如中国专利申请CN1257931A公开了一种可用于人体补铁的铁蛋白及其制备方法和应用，但其发酵过程中菌体生长速率较低，而且制备的铁蛋白是补铁用的菌剂，包载药物的效果较差。因此，本领域需要开发一种适宜大规模制备铁蛋白，即发酵效率高、成本低、铁蛋白质量均一、稳定、易纯化的铁蛋白发酵方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足而提供一种发酵效率高、成本低、易于规模化操作、工艺稳定性优异的铁蛋白的发酵方法。本专利技术的一个方面，是提供一种发酵制备铁蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：（1）将包含铁蛋白编码基因的重组大肠杆菌的种子液接种于发酵培养基中进行培养；（2）发酵培养至OD600在30-60时，加入诱导剂，得到发酵液；（3）收集发酵液中的菌体；（4）破碎收集的菌体，离心，取上清液，即得。所述的发酵培养基由如下组分组成：酵母蛋白胨、酵母抽提物、氯化钠、氯化铵、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁和葡萄糖。优选地，所述的发酵培养基由如下组分组成：酵母蛋白胨10-20g/L、酵母抽提物8-16g/L、氯化钠0.5-2g/L、氯化铵0.5-3g/L、十二水合磷酸氢二钠8-16g/L、磷酸二氢钾1-4g/L、七水合硫酸镁0.1-1g/L和葡萄糖10-20g/L。更优选地，所述的发酵培养基由如下组分组成：酵母蛋白胨14-18g/L、酵母抽提物10-14g/L、氯化钠0.5-2g/L、氯化铵0.5-3g/L、十二水合磷酸氢二钠10-14g/L、磷酸二氢钾1-4g/L、七水合硫酸镁0.1-1g/L和葡萄糖12-16g/L。优选地，所述诱导剂为阿拉伯糖或异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。更优选地，所述诱导剂为阿拉伯糖。更优选地，所述阿拉伯糖的浓度为2-10g/L，所述IPTG的浓度为0.02-0.1g/L。所述铁蛋白可选自来源于哺乳动物来源的铁蛋白、两栖类动物来源的铁蛋白、细菌来源的铁蛋白或植物来源的铁蛋白，优选为哺乳动物来源或细菌来源的铁蛋白单体。所述哺乳动物来源的铁蛋白包括人源性铁蛋白、鼠源性铁蛋白或马脾脏铁蛋白，优选人源性铁蛋白。所述细菌来源的铁蛋白包括幽门螺杆菌铁蛋白、大肠杆菌铁蛋白或激烈火球菌铁蛋白，优选激烈火球菌铁蛋白。所述铁蛋白的来源包括天然提取产物、人工合成产物或基因工程技术产物。所述铁蛋白还包括铁蛋白突变体及铁蛋白衍生物。铁蛋白突变体指在铁蛋白氨基酸序列的基础上，进行氨基酸的置换、截短、延长等操作，但仍具有与铁蛋白相同包载功能的蛋白。铁蛋白衍生物指包含经过人工改造的(经修饰的)铁蛋白亚基的铁蛋白。本领域已知多种经人工改造的铁蛋白亚基，该衍生物适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然氨基酸的聚合物。人工改造（经修饰）的形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。优选地，所述步骤（1）包括如下步骤：将含有铁蛋白编码基因的重组大肠杆菌接种在LB培养基中，得到种子液，当培养至所述种子液的OD600在1.0~3.0时，将所述种子液接种于发酵培养基中进行培养。更优选地，所述步骤（1）包括如下步骤：将含有铁蛋白编码基因的重组大肠杆菌菌种按0.5-3%接种在含有0-50mg/L硫酸链霉素的LB培养基中，得到种子液，当所述种子液的OD600在1.5~2.5时，按0.5-1.5%的接种量接种于发酵培养基中进行培养。本专利技术中的接种百分数没有特殊说明，均为体积百分数。优选地，所述步骤（2）包括如下步骤：在适宜大肠杆菌生长的条件下进行发酵培养，发酵培养OD600至30-60时，加入诱导剂，诱导10-20h后终止发酵，得到发酵液。更优选地，所述适宜大肠杆菌生长的条件为：pH6.5-7.5，温度25-40℃，维持所述发酵培养基的溶氧浓度（DO）20%以上。更优选地，所述溶氧浓度为30-60%。优选地，步骤（2）中还包括补料培养的步骤。所述补料培养是当所述发酵培养基中的碳源耗尽时进行补料。更优选地，当所述发酵培养基中的碳源耗尽时进行补料，补料培养至OD600在30-60，优选45-55时，加入诱导剂，诱导10-20h后终止发酵，得到发酵液。更优选地，当所述发酵培养基中的碳源耗尽时进行第一次补料，OD600在45-55时，停止补料，而后加入诱导剂，5-20min后进行第二次补料，诱导10-20h后终止发酵，得到发酵液。更优选地，所述步骤（2）包括如下步骤：...

【技术保护点】
1.一种发酵制备铁蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n（1）将包含铁蛋白编码基因的重组大肠杆菌的种子液接种于发酵培养基中进行培养；/n（2）发酵培养得到发酵液，其中发酵培养包括补料培养的步骤，所述补料培养是当所述发酵培养基中的碳源耗尽时进行补料，补料培养至OD

【技术特征摘要】
1.一种发酵制备铁蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将包含铁蛋白编码基因的重组大肠杆菌的种子液接种于发酵培养基中进行培养；
（2）发酵培养得到发酵液，其中发酵培养包括补料培养的步骤，所述补料培养是当所述发酵培养基中的碳源耗尽时进行补料，补料培养至OD600在30-60时停止补料，此为第一次补料，而后加入诱导剂，5-20分钟后继续补料至发酵结束，此为第二次补料；诱导10-20h后终止发酵，得到发酵液；所述第一次补料期内通过调控补料速率，维持菌体的比生长速率为0.08~0.16h-1；所述第二次补料期内通过调控补料速率维持菌体的比生长速率为0.02~0.08h-1；
（3）收集发酵液中的菌体；
（4）破碎收集的菌体，离心，取上清液，即得；
所述的发酵培养基由如下组分组成：酵母蛋白胨10-20g/L、酵母抽提物8-16g/L、氯化钠0.5-2g/L、氯化铵0.5-3g/L、十二水合磷酸氢二钠8-16g/L、磷酸二氢钾1-4g/L、七水...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯天一，姚德惠，劳芳，张泽译，希伦，丁凤姣，王晓飞，
申请(专利权)人：昆山新蕴达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32