一种用离子转运蛋白促进谷氨酸棒杆菌合成氨基酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种用离子转运蛋白促进谷氨酸棒杆菌合成氨基酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术以L‑谷氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌G01和L‑精氨酸生产菌株钝齿棒杆菌SDNN403为出发菌株，在其中过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP，分别得到了生产L‑谷氨酸的重组菌GC‑K，和生产L‑精氨酸的重组菌CC‑K。使得L‑谷氨酸的产量较出发菌株提高了31.5％，使得L‑精氨酸的产量较原始菌株提高了36.1％。

【技术实现步骤摘要】
一种用离子转运蛋白促进谷氨酸棒杆菌合成氨基酸的方法
本专利技术公开了一种用离子转运蛋白促进谷氨酸棒杆菌合成氨基酸的方法，属于生物工程

技术介绍
L-谷氨酸和L-精氨酸被广泛应用于食品、医药及化工等行业，其衍生出来的高值化产品γ-氨基丁酸、聚谷氨酸和L-茶氨酸等市场需求量巨大。近年来，随着氨基酸高值化产品需求量不断增大，L-谷氨酸和L-精氨酸高产菌株的选育越来越受到重视。谷氨酸棒杆菌是非致病细菌，是工业上生产各种氨基酸的微生物细胞工厂，如赖氨酸、精氨酸、谷氨酸等。同时其生长迅速且可广泛使用不同的有机化合物作为碳源。实验室在前期工作中，通过逐级诱变获得了一株L-谷氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)G01(中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCCNO:M2013418)和一株高产L-精氨酸的钝齿棒杆菌突变菌株SDNN403(菌株保藏编号为CGMCCNO.0890，在公开号为CN1441055A的专利中已公开)。菌株发酵需要一定的能量供应，而ATP作为主要的供能物质对L-精氨酸合成具有重要作用。糖酵解中丙酮酸激酶对ATP的合成至关重要，又因丙酮酸激酶的活力受到K+的激活。因此适宜K+浓度有利于丙酮酸激酶发挥功能并生成ATP，保证充足的能量供应。近年来，氨基酸高值化产品聚谷氨酸、GABA和L-茶氨酸等市场需求量巨大，而L-谷氨酸和L-精氨酸作为其前体物质，生产菌株中L-谷氨酸和L-精氨酸产量低将会限制高值化产品的高产出，因此，亟待寻找一种提高L-谷氨酸和L-精氨酸产量的方法，以期为高值化产品的生产奠定基础。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP的重组谷氨酸棒杆菌发酵生产L-谷氨酸和L-精氨酸，得到的L-谷氨酸和L-精氨酸产量和产率均提高，对于规模化制备氨基酸具有重要的应用价值。本专利技术提供了一种重组谷氨酸棒杆菌，是过表达了功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP；所述CglK的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，所述CTAP的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术提供了一种重组菌，所述重组菌过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP。在本专利技术的一种实施方式中，所述CglK的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，所述CTAP的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌以pDXW-10为表达载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌以谷氨酸棒杆菌G01，或钝齿棒杆菌SDNN403为宿主。本专利技术提供了一种提高棒杆菌氨基酸产量的方法，所述方法为过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP。在本专利技术的一种实施方式中，在谷氨酸棒杆菌G01中过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP，生产L-谷氨酸。在本专利技术的一种实施方式中，在钝齿棒杆菌SDNN403中过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP，生产L-精氨酸。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述功能性摄钾蛋白CglK的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，编码所述阳离子转运ATP酶CTAP的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，将OD600为20～30的重组菌以5～15％的添加量接入发酵体系，发酵温度为25～35℃，pH值为6.5～7.5。在本专利技术的一种实施方式中，搅拌速度为500～700r/min，空气流量为1～1.5vvm。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵液中含有葡萄糖50～70g/L，酵母浸粉5～10g/L，K3PO43～4g/L，MgSO4·7H2O0.1～1g/L，(NH4)2SO410～25g/L，FeSO4·7H2O0.01～0.05g/L，MnSO4·H2O0.01～0.05g/L。本专利技术还保护所述重组菌，或所述方法在生产L-谷氨酸或L-精氨酸的产品中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术成功在谷氨酸棒杆菌中实现了过表达cglK和ctapK，离子转运蛋白CglK和CTAPK可从培养基中运输足够的K+到胞内。在补料分批发酵中，GC-K菌株L-谷氨酸产量达到120.43g/L，较原始菌提高了31.5％，糖酸转化率为55.7％；CC-K发酵至96h，L-精氨酸产量达到60.72g/L，较原始菌提高了36.1％。附图说明图1为重组菌株GC-K补料分批发酵过程图。图2为重组菌株CC-K补料分批发酵过程图。图3为重组菌在不同钾离子浓度下菌株生长情况。具体实施方式LBG培养基组分：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，葡萄糖5g/L。实施例1：过表达功能性摄钾蛋白CglK重组菌的构建分别以谷氨酸棒杆菌G01和钝齿棒杆菌SDNN403基因组为模板，利用引物对10-cglKctapK-1/2(核苷酸序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示)和10-cglKctapK-3/4(核苷酸序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示)分别扩增出上游cglK和下游ctapK基因片段。回收后，以上下游片段为模板，利用引物对10-cglKctapK-1/4融合PCR扩增出串联基因cglKctapK片段。将pDXW-10质粒经BamHI酶和HindIII酶酶切产物纯化回收，将回收产物和cglKctapK片段利用同源重组酶进行连接，得到连接产物。连接产物经热激转化E.coliBL21感受态，涂布于含有15μg/L的卡那霉素抗性LBG平板，在30℃培养至长出单克隆，挑取单克隆并在含有15μg/L的卡那霉素抗性LBG液体培养基中，培养20h；对菌液进行质粒提取、并进行酶切验证，再将酶切验证通过的送测序验证。验证正确的单克隆即为阳性转化子，表明质粒pDXW-10-cg1KctapK构建成功。将过表达质粒pDXW-10-cg1KctapK分别电击转化至谷氨酸棒杆菌G01和钝齿棒杆菌SDNN403菌株感受态细胞(感受态细胞的制备方法参照徐美娟《钝齿棒杆菌SYPA5-5发酵产L-精氨酸的代谢工程改造》)，培养2h后离心收集细胞涂布于含卡那霉素(15μg/L)抗性的LBG平板。30℃培养36-48h，随机挑取LBG平板上的转化子，利用10-cglKctapK-3/4(核苷酸序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示)的引物进行PCR鉴定，鉴定正确的菌株即为GC-K(宿主为谷氨酸棒杆菌G01)和CC-K菌株(宿主为钝齿棒杆菌SDNN403)。实施例2：不同钾离子浓度下菌株生长的测定分别挑一环平板活化的菌株GC-K和菌株CC-K接入液体LBG培养基中，30℃，180r/min回旋式摇床培养至OD600≈10.0作为种子液。取1mL种子液转接入250mL摇瓶中的25mLL0基本培养基饥饿培养2-3h，无菌PBS洗涤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP；所述CglK的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述CTAP的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP；所述CglK的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，所述CTAP的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。


2.如权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌以pDXW-10为表达载体。


3.如权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌以谷氨酸棒杆菌G01，或钝齿棒杆菌SDNN403为宿主。


4.一种提高棒杆菌氨基酸产量的方法，其特征在于，过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP。


5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在谷氨酸棒杆菌G01中过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP，生产L-谷氨酸。


6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在钝齿棒杆菌SDNN403中过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，徐美娟，刘晶，杨套伟，张显，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32