生产阿魏酸的基因工程菌及阿魏酸的生物合成方法技术

本发明专利技术涉及生产阿魏酸的基因工程菌及阿魏酸的生物合成方法，属于生物学应用技术领域。本发明专利技术解决的技术问题是提供一种生产阿魏酸的基因工程菌，该基因工程菌能够以酪氨酸和甲硫氨酸为原料生产阿魏酸。本发明专利技术根据阿魏酸在植物中的生物合成途径，通过基因工程方法获得重组的基因工程菌，该基因工程菌可以异源表达酪氨酸解氨酶、香豆酸‑3‑羟化酶和咖啡酸‑3‑O‑甲基转移酶，从而促进酪氨酸生物转化，一锅法发酵生产阿魏酸，转化率高，且得到的阿魏酸纯度较高，其工艺简单清洁，成本较低，能够用于大规模工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
生产阿魏酸的基因工程菌及阿魏酸的生物合成方法
本专利技术涉及生产阿魏酸的基因工程菌及阿魏酸的生物合成方法，属于生物学应用

技术介绍
阿魏酸(FerulicAcid)，化学名为3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，属于桂皮酸的衍生物，在植物体内普遍存在，尤其在阿魏、川芎、当归等中药材中含量较高，也是这些中药材的有效成分之一。在食品原料如咖啡、谷壳、香兰豆、麦麸、米糠中阿魏酸含量也较高。阿魏酸分为顺式和反式两种构型，顺式为黄色油状物，反式为正方形结晶或纤维结晶。其中反式阿魏酸能清除自由基，促进清除自由基的酶的产生，增加谷胱甘肽转硫酶和醌还原酶的活性，并抑制酪氨酸酶活性，来调节人体生理机能。广泛应用于医药、农药、保健品、化妆品原料及食品添加剂中，具有较高的经济价值。目前较成熟的阿魏酸生产工艺主要有植物提取法和化学合成法。植物提取法主要包括碱提取法和酶提取法。碱提取法以米糠油来源的谷维素为原料，在高浓度的强碱条件下将谷维素进行水解，再通过酸化沉淀的方法进行收集。此法工艺相对简单，但使用大量的有机溶剂和强酸强碱，对环境污染较大。酶提取法通过真菌、细菌或酵母菌生产阿魏酸酯酶，用液体或固体发酵的方式，将麸皮等原料中的阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸等化合物进行酶解，产生游离的阿魏酸进行收集。但微生物体内的阿魏酸酯酶种类繁多，其酶活、底物特异性等都还有待提高。化学合成法以香兰素为基本原料，主要通过Wittig-Horner反应或者Kneoevenagel反应生产阿魏酸。前者由于强碱的存在，生成酚钠离子会抑制羰基和碳负离子之间的反应，还易发生副反应生成杂质。后者反应时间长达三周，而且获得是反式和顺式阿魏酸混合物，难以进行拆分，从而影响阿魏酸的工业应用。目前，生物合成法由于其高效、清洁，成为阿魏酸合成工艺的研究热点。生物合成法是指利用一些微生物，将阿魏酸前体物质进行转化，得到阿魏酸。比如，将丁香油中提取得到的丁子香酚肉桂酸酯转化为阿魏酸。申请号为201510075678.0的中国专利技术专利公开了一种酶法合成阿魏酸的方法，将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基转移至咖啡酸上，最终形成产物阿魏酸，包括以下步骤：a)通过大肠杆菌的发酵高效表达川芎COMT，通过离心收集菌体，用Tris-HCl缓冲液重悬菌体，超声裂解菌体，获得含有川芎COMT酶的混合酶液；b)由a)所获川芎COMT将SAM提供的甲基转移至咖啡酸，最后转化成阿魏酸。采用该方法，需要先超声破碎菌体，再分离得到含有川芎COMT的混合酶液，其工艺步骤复杂，且以咖啡酸为原料，价格较贵，生产成本高。申请号为201911078868.2的中国专利技术专利公开了了一种基于酶法合成阿魏酸及阿魏酸甲酯方法的优化与改进，包括以下步骤：步骤1：将含有质粒LCCOMT-pET28a的大肠杆菌BL21菌株进行活化；步骤2：对步骤1得到的菌液进行扩大培养后，同时加入IPTG、咖啡酸或咖啡酸甲酯进行共发酵；步骤3：将共发酵后的发酵液离心，用乙酸乙酯萃取后即可得到阿魏酸或阿魏酸甲酯。该方法采用基因工程酶体内转化方法，省去了酶的提取过程，但是，依然以价格较为昂贵的咖啡酸为原料，生产成本高。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供一种生产阿魏酸的基因工程菌，该基因工程菌能够以酪氨酸和甲硫氨酸为原料生产阿魏酸。本专利技术生产阿魏酸的基因工程菌，可以同时表达酪氨酸解氨酶、香豆酸-3-羟化酶和咖啡酸-3-O-甲基转移酶。具体的，该基因工程菌采用如下方法构建得到：将酪氨酸解氨酶基因、S-腺苷甲硫氨酸合成酶5基因和咖啡酸-3-O-甲基转移酶基因连接至载体，并转化至宿主细胞，筛选阳性克隆，得到基因工程菌。作为一种实施方式，所述载体为pBR322或pET21c。优选的，所述感受态细胞为大肠杆菌。作为具体实施方式，所述感受态细胞为JM109、BL21(DE3)或Rosetta。本专利技术解决的第二个技术问题是提供一种阿魏酸的生物合成方法。本专利技术阿魏酸的生物合成方法，包括如下步骤：将上述的生产阿魏酸的基因工程菌接种培养基中，振荡培养，得到含有阿魏酸的发酵液，分离纯化，得到阿魏酸；其中，所述培养基中含有酪氨酸、甲硫氨酸和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。作为其中一种实施方式，所述培养基中含有0.5～10g/L酪氨酸、0.5～10g/L甲硫氨酸和0.05～0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。作为具体的实施方式，所述培养基中含有1g/L酪氨酸、1g/L甲硫氨酸和0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。作为其中一种实施方式，所述振荡培养的温度为22～37℃，时间为3～10天。菌体发酵后，可以得到含有阿魏酸的发酵液，可以采用本领域的常规方法从该发酵液中分离纯化得到阿魏酸，优选的，采用有机溶剂萃取法或树脂吸附分离法进行分离纯化。作为其中一种实施方式，采用有机溶剂萃取法进行分离纯化。所述有机溶剂萃取法具体操作为：将含有阿魏酸的发酵液离心，上清液进行浓缩后，有机溶剂萃取，萃取液用氢氧化钠溶液萃取，将pH调至酸性，结晶，得阿魏酸。作为优选方案，有机溶剂萃取法具体操作为：将含有阿魏酸的发酵液离心，上清液旋蒸浓缩后，用等体积的有机溶剂萃取3次，合并萃取液，浓缩后再用等体积的氢氧化钠溶液萃取3次，将pH调至酸性，结晶，得阿魏酸。其中，作为其中一种实施方式，其中，所述有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯或石油醚。作为优选实施方式，所述有机溶剂为乙酸乙酯。作为另一种实施方式，采用树脂分离法进行分离纯化。所述树脂吸附分离法的具体操作为：将含有阿魏酸的发酵液离心，上清液投入大孔树脂或离子交换树脂，搅拌吸附过夜，用纱布过滤收集树脂，纯化水冲洗干净后装填层析柱，再用纯化水冲洗至无色，用30％～70％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，旋蒸除净乙醇，将pH调至酸性，结晶获得阿魏酸结晶。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术根据阿魏酸在植物中的生物合成途径，通过基因工程方法获得重组的基因工程菌，该基因工程菌可以异源表达酪氨酸解氨酶、香豆酸-3-羟化酶和咖啡酸-3-O-甲基转移酶，从而促进酪氨酸生物转化，一锅法发酵生产阿魏酸，转化率高。本专利技术生产阿魏酸的方法，能够成功将酪氨酸转化为阿魏酸，转化率高，得到的阿魏酸纯度较高，其工艺简单清洁，条件温和，成本较低，能够用于大规模工业化生产。本专利技术生产阿魏酸的方法，无需对基因工程菌进行破碎，也无需对酶进行提取，其工艺流程短，操作简单环保。具体实施方式本专利技术生产阿魏酸的基因工程菌，可以同时表达酪氨酸解氨酶(TAL)、香豆酸-3-羟化酶(C3H)和咖啡酸-3-O-甲基转移酶(COMT)。本专利技术生产阿魏酸的基因工程菌，将阿魏酸合成途径中参与的酶在基因工程菌中进行异源表达，以酪氨酸和甲硫氨酸为原料生产阿魏酸。阿魏酸以酪氨酸为原料的合成途径为：TAL：Tyrosineammonia-lyase，酪氨酸解氨酶。C3H：Coumarate-3-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.生产阿魏酸的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌同时表达酪氨酸解氨酶、香豆酸-3-羟化酶和咖啡酸-3-O-甲基转移酶。/n

【技术特征摘要】
1.生产阿魏酸的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌同时表达酪氨酸解氨酶、香豆酸-3-羟化酶和咖啡酸-3-O-甲基转移酶。


2.根据权利要求1所述的生产阿魏酸的基因工程菌，其特征在于，采用如下方法构建得到：将酪氨酸解氨酶基因、S-腺苷甲硫氨酸合成酶5基因和咖啡酸-3-O-甲基转移酶基因连接至载体，并转化至宿主细胞，筛选阳性克隆，得到基因工程菌。


3.根据权利要求2所述的生产阿魏酸的基因工程菌，其特征在于：所述载体为pBR322或pET21d。


4.根据权利要求2所述的生产阿魏酸的基因工程菌，其特征在于：所述宿主细胞为大肠杆菌；优选所述宿主细胞为E.coliJM109、E.coliBL21(DE3)或E.coliRosetta。


5.阿魏酸的生物合成方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1～4任一项所述的生产阿魏酸的基因工程菌接种到培养基中，振荡培养，得到含有阿魏酸的发酵液，分离纯化，得到阿魏酸；其中，所述培养基中含有酪氨酸、甲硫氨酸和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。


6.根据权利要求5所述的阿魏酸的生物合成方法，其特征在于：所述培养基中含有0.5～10g/L酪氨酸、0.5～10g/L甲硫氨酸和0...

【专利技术属性】
技术研发人员：华君，王勇，裴亮，潘月，华卿汝，
申请(专利权)人：四川盈嘉合生科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51