一种原核表达细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术实施例涉及一种原核表达细胞及其制备方法和应用，该原核表达细胞能共表达肝素酶I HepA’和分子伴侣素CpkA。肝素酶I HepA’的氨基酸序列中，关键是用带净正电荷的信号标签肽取代HepA中前导肽氨基酸序列。改造后的含有一段带净正电荷的信号标签肽的肝素酶I HepA’在原核表达细胞中的表达量大大提高，尤其是存在于上清液中的蛋白量大大提高；同时由于CpkA的羧基端带净负电荷，其与带净正电荷的信号标签肽产生静电相互作用，使得CpkA和HepA’结合力更强，因此CpkA可以更有效地帮助HepA’折叠成正确的构象，从而提高其可溶性表达。

【技术实现步骤摘要】
一种原核表达细胞及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种原核表达细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
低分子量肝素(lowmolecularweightheparin，LMWH)是近几年出现的一种新型的肝素类抗血栓药物，是由普通肝素经物理化学反应解聚制备而成的一类分子量较小的组分，分子量约为3000-7000，作用机理主要是通过与抗凝血酶结合使凝血因子Xa和IIa失活，从而达到抗凝作用。与普通肝素相比，低分子量肝素具有更多的优点，如抗血栓作用更显著，且体内半衰期长，生物利用率高，口服易吸收，出血等副作用小等等。目前制备低分子量肝素最常用的方法仍然是利用肝素酶裂解获得。肝素酶是指一大类特异性裂解肝素或者硫酸乙酰肝素等肝素结构类似物的多糖裂解酶。肝素酶I(HepA，EC4.2.2.7)最初从Favobacteriumheparinum中分离出来，肝素酶I的基因序列全长是1155bp，同时编码384个氨基酸，其中第1-21个氨基酸是前导肽部分，具有常见的Ala-X-Ala结构。肝素酶I能以位点依赖的方式特异性地切割肝素/硫酸肝素，从而在生产低分子量肝素的领域有巨大潜力。但重组HepA在原核表达系统，如大肠杆菌中，表达难度较大，存在蛋白表达量小、蛋白纯度低、蛋白溶解性差等问题。1992年，Sasisekharan等人首次从肝素黄杆菌中克隆并成功获得不含前21个氨基酸的肝素酶I基因，将其转至大肠杆菌DE3中重组表达，发现DE3可以表达获得HepI蛋白，但主要以包涵体形式存在，经复性变性后，获得的肝素酶I酶活也很低。为了提高HepI在大肠杆菌中的可溶性表达量并分离纯化出所需蛋白，科学家们一直在努力，Ernst等人将肝素酶I基因尝试克隆在不同的表达载体上表达，发现在pET-12a和pET-28a载体上，肝素酶I均以无活性的包涵体形式存在。而在载体pET-15b上也仅可以产生少量目的蛋白，且活性极低，对包涵体进行复性操作后，也没有得到酶活。Huang等(JingHuang,etal.EnhancedsolubleexpressionofrecombinantFlavobacteriumheparinumheparinaseIinEscherichiacolibyfusingitwithvarioussolublepartners.ProteinExpressionandPurification83(2012)169–176，本专利技术中称为文献1)通过将HepA基因C端克隆和融合5种可溶性伴侣，尝试提高重组HepA在大肠杆菌中表达系统中的溶解度，但该技术容易使得大肠杆菌表达菌株在进行表达时，因为要合成单个巨大的融合蛋白质而产生代谢负担，影响表达以及活性。因此有必要改进现有技术。分子伴侣是一大类能够识别并结合到不完整折叠或装配的多肽或蛋白质，并帮助其折叠成正确的空间结构的蛋白。分子伴侣主要被分为以下几类：Hsp70家族、Hsp90家族、Hsp60即分子伴侣素等。其中分子伴侣素的主要功能是帮助胞内新生肽链正确折叠。从嗜热菌Thermococcuskodakarensis中提取发现了两个分子伴侣素，即冷诱导型CpkA和热诱导型CpkB，CpkA由548个氨基酸组成，适应低温；CpkB由546个氨基酸组成，编码一分子量为59.14kDa的蛋白质，适应高温。这两个分子伴侣素具有高度序列同一性(77％)。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术的目的在于提供一种能共表达肝素酶IHepA’和分子伴侣素CpkA的原核表达细胞及其制备方法和应用。肝素酶IHepA’的氨基酸序列中，用带净正电荷的信号标签肽取代HepA中前导肽氨基酸序列，改造后的含有一段带净正电荷的信号标签肽的肝素酶IHepA’在原核表达细胞中的表达量大大提高，尤其是存在于上清液中的蛋白量大大提高；同时由于CpkA的羧基端带净负电荷，其与带净正电荷的信号标签肽产生静电相互作用，使得相比于CpkA和细胞内其他蛋白质的结合力而言，CpkA和HepA’结合力更强，因此CpkA可以更有效地帮助HepA’在原核表达细胞内折叠成正确的构象，从而提高其可溶性表达。解决方案为实现本专利技术目的，本专利技术实施例提供了以下技术方案：一种原核表达细胞，所述原核表达细胞内包括：含有编码肝素酶IHepA’的DNA序列的第一重组表达载体和含有编码分子伴侣素CpkA的DNA序列的第二重组表达载体；所述肝素酶IHepA’的氨基酸序列中包括：HepA前导肽被带净正电荷的信号标签肽取代后的HepA的氨基酸序列；且第一重组表达载体和第二重组表达载体的骨架载体为能在原核表达细胞内共同表达的载体。肝素酶IHepA’是一种经过改造的HepA，如上所述，肝素酶IHepA’的氨基酸序列中包括：HepA前导肽被带净正电荷的信号标签肽取代后的HepA的氨基酸序列，即肝素酶IHepA’的氨基酸序列中包括：带净正电荷的信号标签肽，以及HepA中除去前导肽的部分，其中HepA中除去前导肽的部分既可以是其本身的氨基酸序列，也可以是HepA中除去前导肽的部分经过突变、缺失、增加后仍能保持HepA功能的氨基酸序列。在一种可能的实现方式中，被取代的HepA前导肽的氨基酸序列为MKKQILYLIVLQQLFLCSAYA(SEQIDNO:1)；取代HepA前导肽的且带净正电荷的信号标签肽的氨基酸序列选自下表的任意一条：在一种可能的实现方式中，第一重组表达载体中，编码带净正电荷的信号标签肽的DNA序列的5’端还连接有编码MGSSHHHHHH氨基酸序列的DNA序列。组氨酸的加入为了方便纯化。在一种可能的实现方式中，第一重组表达载体和第二重组表达载体的骨架载体为能共同表达的任意两种质粒；可选地，含有编码肝素酶IHepA’的DNA序列的表达载体为pET28a，含有编码分子伴侣素CpkA的DNA序列的表达载体为pACYC-Duet。在一种可能的实现方式中，所述原核细胞为大肠杆菌。在一种可能的实现方式中，所述分子伴侣素CpkA为来自Thermococcuskodakarensis的CpkA。本专利技术实施例还提供了上述原核表达细胞的制备方法，包括以下步骤：将编码肝素酶IHepA’的DNA序列连接至第一表达载体中构建第一重组表达载体；将编码分子伴侣素CpkA的DNA序列连接至第二表达载体中构建第二重组表达载体，所述第二表达载体能与第一表达载体在原核表达细胞中共表达；将第一重组表达载体和第二重组表达载体共转化至原核表达细胞中。本专利技术实施例还提供了一种在原核表达细胞中表达可溶性肝素酶I的方法，包括使用上述原核表达细胞进行共表达的步骤。本专利技术实施例还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有编码肝素酶IHepA’的DNA序列，所述肝素酶IHepA’的氨基酸序列中包括：H本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种原核表达细胞，其特征在于，所述原核表达细胞内包括：/n含有编码肝素酶I HepA’的DNA序列的第一重组表达载体和含有编码分子伴侣素CpkA的DNA序列的第二重组表达载体；/n所述肝素酶I HepA’的氨基酸序列包括：HepA前导肽被带净正电荷的信号标签肽取代后的HepA的氨基酸序列；/n且第一重组表达载体和第二重组表达载体的骨架载体为能在原核表达细胞内共同表达的载体；/n可选地，被取代的HepA前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；/n取代HepA前导肽的且带净正电荷的信号标签肽的氨基酸序列选自下表的任意一条：/n

【技术特征摘要】
1.一种原核表达细胞，其特征在于，所述原核表达细胞内包括：
含有编码肝素酶IHepA’的DNA序列的第一重组表达载体和含有编码分子伴侣素CpkA的DNA序列的第二重组表达载体；
所述肝素酶IHepA’的氨基酸序列包括：HepA前导肽被带净正电荷的信号标签肽取代后的HepA的氨基酸序列；
且第一重组表达载体和第二重组表达载体的骨架载体为能在原核表达细胞内共同表达的载体；
可选地，被取代的HepA前导肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；
取代HepA前导肽的且带净正电荷的信号标签肽的氨基酸序列选自下表的任意一条：





2.根据权利要求1所述的原核表达细胞，其特征在于，第一重组表达载体中，编码带净正电荷的信号标签肽的DNA序列的5’端还连接有编码MGSSHHHHHH氨基酸序列的DNA序列。


3.根据权利要求1所述的原核表达细胞，其特征在于，第一重组表达载体和第二重组表达载体的骨架载体为能共同表达的任意两种质粒；可选地，含有编码肝素酶IHepA’的DNA序列的表达载体为pET28a，含有编码分子伴侣素CpkA的DNA序列的表达载体为pACYC-Duet。


4.根据权利要求1所述的原核表达细胞，其特征在于，所述原核细胞为大肠杆菌；
和/或，所述分子伴侣素CpkA为来自Thermococcuskodakarensis的CpkA。...

【专利技术属性】
技术研发人员：高乐，王壹，张昊，栗慧超，于源华，宋禹，
申请(专利权)人：科赫生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11