【技术实现步骤摘要】
本公开属于重组蛋白领域。具体地，本公开涉及一种铁蛋白融合物及由该融合物自组装形成的纳米颗粒及其用途，涉及用铁蛋白载带不同生物活性功能的分子，以达到治疗、靶向、标记、示踪、修饰等不同的生物功能。
技术介绍
1、天然铁蛋白由两种不同的铁蛋白亚基(h亚基和l亚基)构成，h亚基和l亚基的分子质量分别为21kda和19kda。典型的铁蛋白结构是由24个轻链/重链亚基自组装形成的球壳状结构，外径12nm，内部形成直径8nm的内腔结构。已有报道，通过重组方式制备铁蛋白融合蛋白，即将具有生物活性功能的肽、蛋白质(如抗体、抗原片段、能够与受体结合的配体、靶向肽、治疗肽、标记肽、受体结合肽、剪切肽、信号肽、细胞凋亡前肽、荧光蛋白等)融合于人铁蛋白hfn的n端或者c端，以赋予hfn靶向性、示踪性、治疗性和预防性(融合方式构建的文献参见：wo2017039382a1，wo2016122259a1，kr-2018008349，wo2013055058a2，wo2018012952a1，cn104017088a，“ferritin nanocages with biologically orthogonalconjugation for vascular targeting and imaging,bioconjugate chem,2018,29,4,1209–1218”等)的生物学功能，同时，能延长外源生物活性部分的半衰期、增强其免疫原性、增加单分子效价等。目前，通过重组表达的方式能够稳定、快速、经济的获得具有特定生物学活性的铁蛋白融合蛋白，该铁蛋白融
2、然而，在融合蛋白构建过程中，常规的方式是将需融合的目标蛋白序列连接于铁蛋白编码序列的n端或c端，一般认为，这可能使得目标蛋白至少一端处于活动状态，有利于折叠成为具备生物活性的空间构象。而事实上，在实践中仍旧发现有大量的目的片段无法顺利表达，或表达后难以维持目的蛋白原本的生物功能。因此，开发适合更多种类目的蛋白表达的铁蛋白载体平台，是拓展铁蛋白在更多领域应用的需要。
技术实现思路
1、本公开在用基因工程重组的方法开发不同生物活性功能的铁蛋白载体系统的过程中，根据铁蛋白自组装的笼状蛋白结构的蛋白高级结构特点，对比了不同外源片段插入区域，和不同外源连接位置的结果，意外的发现，与传统的在铁蛋白单体亚基的n末端或c末端顺序连接目的蛋白相比，在铁蛋白的de loop区域插入外源目的蛋白的片段，目的蛋白更容易被表达，且更大几率提高外源目的蛋白的生物学活性。该插入位点的发现，拓展了可以利用铁蛋白作为载体的外源蛋白种类，让铁蛋白载体平台具有更宽的应用场景和更广的用途。
2、本公开尝试了用不同序列的外源生物活性片段，连接或插入到铁蛋白不同的loop区域，ab loop、bc loop、cd loop和de loop，同时比较n端和c端顺序连接的效果，从而创造性的发现若干构建方式中，选择在de loop区域插入外源片段，更有利于蛋白的表达、以及插入片段活性构象的形成。
3、本公开用于构建融合蛋白的铁蛋白单体亚基序列可以选自野生型，也可以选自经过了点突变改造的铁蛋白单体亚基的变体，这些变体自组装形成铁蛋白后聚集体比例降低、亲水性增加，生物利用度增加。
4、具体来说，本公开提出了如下技术方案：
5、在一方面，本公开提供了一种铁蛋白融合物。
6、在一方面，本公开提供了一种包含前述铁蛋白融合物的纳米颗粒。
7、在一方面，本公开提供了一种用于生产前述铁蛋白融合物或纳米颗粒的方法。
8、在一方面，本公开提供了一种包含前述铁蛋白融合物或纳米颗粒的组合物。
9、在一方面，本公开提供了前述铁蛋白融合物、纳米颗粒、以及组合物在制备靶向分子、治疗分子、检测分子、示踪分子、调节分子或修饰分子中的用途。
10、在一方面，本公开提供了前述的铁蛋白融合物、纳米颗粒或组合物在制备靶向抗癌药物中的应用。
11、在一方面，本公开提供了用于制备靶向分子、治疗分子、检测分子、示踪分子、调节分子或修饰分子的前述铁蛋白融合物、纳米颗粒以及组合物。在一方面，本公开提供了用于制备靶向抗癌药物的前述铁蛋白融合物、纳米颗粒以及组合物。
12、在一方面，本公开提供了一种治疗肿瘤的方法，其包括向有需要的患者提供治疗有效量的前述铁蛋白融合物、纳米颗粒以及组合物。
13、与现有技术相比，本公开具有如下有益效果：
14、(1)本公开构建的铁蛋白融合物能够自组装形成笼状纳米颗粒，且插入的外源目的片段负载于铁蛋白纳米颗粒的外表面，且能够形成具有生物活性的空间构象，从而形成具备特定功能的铁蛋白载体系统。
15、(2)构建的铁蛋白融合物自组装形成的纳米颗粒为24聚体，与外源目的片段相比，半衰期延长，单分子效价高达24价，提高了单分子的生物效价和活性。
16、(3)人重链铁蛋白具有结合转铁蛋白受体tfr1的主动靶向性，该靶点在多种肿瘤细胞中高表达，因此当选用人重链铁蛋白作为外源目的片段的插入载体时，可利用该主动靶向性将外源目的蛋白带到肿瘤部位，发挥示踪、治疗功能。同时，铁蛋白纳米颗粒具有纳米粒子的epr效应(实体瘤的高通透性和滞留效应)，该效应让纳米颗粒更容易进入肿瘤内部，发挥示踪、治疗作用。
17、(4)本公开用大肠杆菌表达系统获得铁蛋白融合物，能够简单、高产量的自组装形成具有结合活性的纳米颗粒，制备方法简单，成本大幅降低，易操作，具有高成药价值和产业化价值。
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1.一种铁蛋白融合物，其特征在于，包括：(a)铁蛋白单体亚基或其变体，和(b)生物活性部分；所述生物活性部分包含氨基酸成分，且插入至(a)的序列中。
2.如权利要求1所述的铁蛋白融合蛋白，其特征在于，所述铁蛋白单体亚基或其变体为人铁蛋白单体亚基或其变体，优选人重链铁蛋白单体亚基或其变体；
3.如权利要求1或2所述的铁蛋白融合物，其特征在于，所述的铁蛋白单体亚基或其变体的氨基酸序列包含与SEQ ID NO.1-6任一项所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述重链铁蛋白单体亚基或其变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-6任一项所示。
4.如权利要求1-3任一项所述的铁蛋白融合物，其特征在于，所述的生物活性部分为肽段或蛋白，优选的，所述的肽段和蛋白选自抗体、抗原、靶向肽、治疗肽、标记肽、受体结合肽、剪切肽或信号肽，所述肽段或蛋白的长度为3-40个氨基酸，优选3-30个氨基酸；
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6.一种纳米颗粒，其由至少一个权利要求1-5任一项所述的铁蛋白融合物和任选的铁蛋白单体亚基或其变体自组装而形成，且其中所述纳米颗粒在其表面上展示所述的生物活性部分，所述生物活性部分保持其天然状态下至少50％的生物活性功能；
7.用于生产权利要求1-5任一项所述的铁蛋白融合物、或权利要求6所述的纳米颗粒的方法，所述方法包括将编码所述铁蛋白融合物和任选的编码所述的铁蛋白单体亚基或其变体的核酸分子导入细胞中，并在适合于表达编码的铁蛋白融合物和/或编码的铁蛋白单体亚基或其变体、或形成纳米颗粒的条件下培养所述细胞；优选地，所述细胞为大肠杆菌细胞。
8.一种组合物，其包含权利要求1-5任一项所述的铁蛋白融合物、权利要求6所述的纳米颗粒或根据权利要求7所述的方法生产的铁蛋白融合物或纳米颗粒中的至少一种。
9.权利要求1-5任一项所述的铁蛋白融合物、权利要求6所述的纳米颗粒、权利要求7所述的方法生产的铁蛋白融合物或纳米颗粒或权利要求8所述的组合物在制备靶向分子、治疗分子、示踪分子、调节分子或修饰分子中的应用。
10.权利要求1-5任一项所述的铁蛋白融合物、权利要求6所述的纳米颗粒、权利要求7所述的方法生产的铁蛋白融合物或纳米颗粒或权利要求8所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征在于，所述抗肿瘤药物为靶向抗癌药物。
...【技术特征摘要】
1.一种铁蛋白融合物，其特征在于，包括：(a)铁蛋白单体亚基或其变体，和(b)生物活性部分；所述生物活性部分包含氨基酸成分，且插入至(a)的序列中。
2.如权利要求1所述的铁蛋白融合蛋白，其特征在于，所述铁蛋白单体亚基或其变体为人铁蛋白单体亚基或其变体，优选人重链铁蛋白单体亚基或其变体；
3.如权利要求1或2所述的铁蛋白融合物，其特征在于，所述的铁蛋白单体亚基或其变体的氨基酸序列包含与seq id no.1-6任一项所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述重链铁蛋白单体亚基或其变体的氨基酸序列如seq id no.1-6任一项所示。
4.如权利要求1-3任一项所述的铁蛋白融合物，其特征在于，所述的生物活性部分为肽段或蛋白，优选的，所述的肽段和蛋白选自抗体、抗原、靶向肽、治疗肽、标记肽、受体结合肽、剪切肽或信号肽，所述肽段或蛋白的长度为3-40个氨基酸，优选3-30个氨基酸；
5.如权利要求1-4任一项所述的铁蛋白融合物，其特征在于，所述的铁蛋白融合物包含与seq id no.12-15和18中任一项所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一...
【专利技术属性】
技术研发人员：柯天一，姚德惠，劳芳，张泽译，闫西冲，丁凤姣，赵梦蕊，
申请(专利权)人：昆山新蕴达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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