铁蛋白示踪多肽缀合物及其用途制造技术

本公开涉及一种铁蛋白示踪多肽缀合物及其用途。所述铁蛋白示踪多肽缀合物包含铁蛋白H亚基(HFn)突变体多肽，所述铁蛋白H亚基(HFn)突变体多肽包含选自SEQ ID NO:5

【技术实现步骤摘要】
铁蛋白示踪多肽缀合物及其用途


[0001]本公开属于生物医学领域，涉及一种包含铁蛋白重链亚基突变体的多肽缀合物及其在示踪上的用途，具体地，涉及用于铁蛋白纳米造影剂及其制备方法，以及其在肿瘤外科手术中淋巴结染色和影像学诊断中的应用。

技术介绍

[0002]前哨淋巴结(SLN)是指某器官的具体部位发生原发肿瘤，肿瘤细胞最早侵犯的第一站淋巴结。前哨淋巴结活检是评估早期乳腺癌腋窝淋巴结转移状态的可靠方法。选择合适的前哨淋巴结示踪技术是术中精准寻找前哨淋巴结的关键，提高前哨淋巴结的检出率、降低假阴性率可减少患者腋窝损伤。前哨淋巴结示踪方法主要有染料法(包括蓝染料和荧光染料等)、纳米炭法、放射性核素法、超顺磁氧化铁及上述染色剂的联合示踪法。蓝染料法成本低廉，应用广泛，但易出现跃迁。纳米炭法生物相容性高，但需严格把握染色时间。超顺磁氧化铁的检出率与假阴性率均与标准的联合法相似，但对手术器械材质要求高。荧光染料法可实时成像，敏感性高，但术中操作繁琐。目前最常用的荧光染料为吲哚菁绿(Indocyanine Green，ICG)，是一种高灵敏近红外荧光素，其已经被美国FDA批准用于临床。但其对淋巴结的显像也存在明显的局限性，一是ICG缺乏特异性，无法区分肿瘤转移的前哨淋巴结与炎性增生的次级淋巴结；二是ICG在手术过程中淬灭的问题也影响了其准确性。核素法检出率高，但肉眼无法直接识别。
[0003]目前仍旧缺乏能够快速、安全、低损伤、准确的在肿瘤外科手术中示踪前哨淋巴结的有效方法。而铁蛋白(Ferritin)是一种大约450kDa的大蛋白，由24个亚基自组装成球形笼状结构，其内部和外部尺寸分别为大约8nm和大约12nm。由于铁蛋白具有能与转铁蛋白受体(TfR1)结合的活性，而TfR1被发现在多种肿瘤细胞中高表达，具有主动靶向性。同时其又具备尺寸小的特点，能到达肿瘤组织深处，因此本领域已经尝试将铁蛋白在肿瘤领域中用作各种生活活性分子的运送载体，发挥诊断，影像示踪及治疗作用。铁蛋白作为运送载体的递送方式分为两种，一是将生物活性分子，如小分子药物阿霉素装载在笼状空腔内；另一种递送方式是可将生物活性分子偶联在铁蛋白外表面，该方式与包载于铁蛋白内腔的内包方式相比，可载带的生物活性分子类型更多，且不受铁蛋白内部空间的限制，也无需考虑到达靶部位后，如何将笼内分子释放方式等问题，因此该递送方式具备更广阔的应用前景。
[0004]目前文献报道的铁蛋白外表面偶联生物活性分子的方法可以通过生物学方式，也可通过化学方式。相对于繁复的生物学构建方式，用化学方法将生物活性分子偶联到铁蛋白外表面则更方便灵活，可通过各种化学反应高通量、快速的将各种生物活性分子偶联在铁蛋白表面，并可同时偶联多种功能分子。化学偶联法的关键在于提供优化的，适用于化学偶联场景的铁蛋白突变体。因为虽然野生型铁蛋白与其它载体蛋白相比，其已然具有良好的pH和温度稳定性，且易于用原核表达的方式方便的大规模制备，但其在化学反应条件中仍无法避免的出现易聚合、易生成杂质、偶联效率低(键合率低)、偶联产物不稳定等问题。而目前对于适用于化学偶联场景的铁蛋白突变体的研究和开发甚少，本领域对此有迫切的
需求。将铁蛋白突变体与不同的生物活性分子偶联，可以在肿瘤治疗、诊断或示踪中发挥积极作用。
[0005]专利技术概述
[0006]本公开构建了成药性、稳定性和偶联效果更好的铁蛋白突变体多肽，并用化学偶联方式将突变体多肽与前哨淋巴结显像分子缀合，获得的突变体多肽缀合物以及笼状蛋白，能解决目前哨淋巴结示踪技术存在的有效剂量高、分辨率低、易淬灭的问题，为肿瘤诊断和手术操作中对前哨淋巴区域的定位提供了更灵敏、准确、安全、损伤小的显像剂。
[0007]在第一方面，本公开提供铁蛋白H亚基突变体多肽，其相对于野生型铁蛋白H亚基，包含在对应于SEQ ID NO:1的第98位、第108位、和/或第156位的位置处的氨基酸取代。
[0008]在某些实施方式中，所述的突变体多肽，相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第98位、第108位、和/或第156位的位置处的氨基酸被亲水性更高的氨基酸例如带羧基侧链的氨基酸取代。
[0009]在某些实施方式中，所述的突变体多肽，其中所述带羧基侧链的氨基酸选自谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)或组氨酸(H)。
[0010]在某些实施方式中，所述的突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第98位的位置处的氨基酸例如天冬酰胺(N)被天冬氨酸(D)取代。
[0011]在某些实施方式中，所述的突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第108位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(K)被谷氨酸(E)取代。
[0012]在某些实施方式中，所述的突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第156位的位置处的氨基酸例如精氨酸(R)被组氨酸(H)取代。
[0013]在某些实施方式中，所述的突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第98位的位置处的氨基酸例如天冬酰胺(N)被天冬氨酸(D)取代，且在对应于SEQ ID NO:1的第108位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(K)被谷氨酸(E)取代。
[0014]在某些实施方式中，所述的突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第98位的位置处的氨基酸例如天冬酰胺(N)被天冬氨酸(D)取代，在对应于SEQ ID NO:1的第108位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(K)被谷氨酸(E)取代，且在对应于SEQ ID NO:1的第156位的位置处的氨基酸例如精氨酸(R)被组氨酸(H)取代。
[0015]在某些实施方式中，其相对于野生型铁蛋白H亚基，所述的突变体多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的第62位和/或第65位的位置处的氨基酸取代。
[0016]在某些实施方式中，所述的突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第62位的位置处的氨基酸例如谷氨酸(E)被取代为赖氨酸(K)。
[0017]在某些实施方式中，所述的突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第65位的位置处的氨基酸例如组氨酸(H)被取代为甘氨酸(G)。
[0018]在某些实施方式中，所述的突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第62位的位置处的氨基酸例如谷氨酸(E)被取代为赖氨酸(K)，且在对应于SEQ ID NO:1的第65位的位置处的氨基酸例如组氨酸(H)被取代为甘氨酸(G)。
[0019]在某些实施方式中，其中相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽包含减少的半胱氨酸。
[0020]在某些实施方式中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第90、102和130位的
位置处的半胱氨酸的至少一个被取代。其中所述半胱氨酸被选自以下的氨基酸取代：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、甘氨酸，优选被丝氨酸或被野生型铁蛋白轻链(L)亚基多肽相应位置处的氨基酸取代。
[0021]在某些实施方式中，相对于野生型铁蛋白H亚基，所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种铁蛋白H亚基(HFn)突变体多肽，其包含选自SEQ ID NO:5
‑
8之一的氨基酸序列。2.一种多肽缀合物，其包含铁蛋白H亚基突变体多肽，和通过所述铁蛋白H亚基突变体多肽的巯基与其缀合的生物活性部分，所述铁蛋白H亚基突变体多肽序列包含选自SEQ ID NO:5
‑
8之一的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的多肽缀合物，其中所述生物活性部分选自治疗性分子、可检测分子或靶向性分子；优选地，所述可检测分子选自染料分子、荧光分子、发光化学物质、酶、同位素、标签；可选的，所述生物活性部分通过接头与所述铁蛋白H亚基突变体多肽的巯基缀合。4.根据权利要求3所述的多肽缀合物，其中所述染料分子选自美蓝、伊文思蓝、异硫蓝、亚甲蓝和专利蓝；所述的荧光分子为近红外荧光染料，例如菁染料类、罗丹明类、芳酸类、卟啉类，优选吲哚菁绿、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、IR
‑
782、IR820和IR
‑
783；所述同位素为
99m Tc。5.根据权利要求3或4所述的多肽缀合物，其中所述生物活性部分为吲哚菁绿；所述的接头为马来酰亚胺。6.权利要求2
‑
5中任一项所述的多肽缀合物的制备方法，其包括如下步骤：(1)制备权利要求1所述的铁蛋白H亚基突变体多肽；(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯天一，丁会，姚德惠，劳芳，刘岩，赵梦蕊，张泽译，闫西冲，
申请(专利权)人：昆山新蕴达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：