一种枯草芽孢杆菌高效稳定的双质粒系统技术方案

本发明专利技术公开了一种枯草芽孢杆菌高效稳定的双质粒系统，属于基因工程领域。本发明专利技术构建了适用于双质粒转化的载体。省去了先在大肠杆菌中进行多拷贝复制，可直接进行枯草芽孢杆菌的转化，并且能够通过通过外源添加相应的诱导剂，诱导目的蛋白的表达。此系统表达效果稳定，以枯草芽孢杆菌为宿主，得到的产物安全无致病性，适用于多种生产场景。

【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌高效稳定的双质粒系统
本专利技术涉及一种枯草芽孢杆菌高效稳定的双质粒系统，属于基因工程领域。
技术介绍
质粒是一种共价闭合环状的DNA且具有自我复制和表达外源基因的功能。由于其在不同的宿主中具有良好的自我复制能力，所以在基因工程及分子生物学领域中常被作为载体用于表达目的基因。在进行基因工程的改造和研究中通常一个宿主菌中只转化一种质粒，这是因为质粒具有不相容性，即同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内。目前也有转化同一种质粒到大肠杆菌中构建形成双质粒系统进行双酶的表达。通过添加抗生素作为外部选择压力使双质粒保持稳定，但表达得到的酶产量及效果都不太理想。目前已经报道的在微生物中关于基因震荡器的内容，主要是通过单一诱导剂对其中的抑制蛋白进行表达调控，从而对对应需要激活剂激活表达的启动子产生抑制效果。该可抑制启动子分别启动报告基因和激活剂的转录表达。而且构建所用的宿主菌多为大肠杆菌，但大肠杆菌是领域公知的致病菌，影响了蛋白的安全性，并且若重组表达的外源蛋白中含有大量连续的稀有密码子，则常常造成表达量低，或翻译提前终止，目标蛋白质容易形成包涵体而不可溶。因此，需要提供一种能够便于调控、并有效表达蛋白、又具有安全性能的表达系统。
技术实现思路
为解决上述存在的问题，本专利技术构建了一种适用于双质粒转化的载体。将pHT01和pBSG03穿梭载体，通过删除复制起点Ori(pHT01和pBSG03同为穿梭载体，在大肠杆菌中的复制子是相同的，如果不进行删除就转化双质粒会造成两个质粒上由于有相同基因序列而发生交换，造成质粒的不稳定)，改造成了只能在枯草芽孢杆菌中复制的pHTminP43-sfGFP和pBminP43-mcherry双质粒，从而使得在枯草芽孢杆菌中构建双质粒得方法更加简便有效(省去了先在枯草芽孢杆菌中进行多拷贝复制，可直接进行枯草芽孢杆菌的转化)。本专利技术提供了一种重组枯草芽孢杆菌，含有双质粒系统，所述双质粒系统包含如下两种质粒：第一质粒：含有诱导型启动子A、目的蛋白A和诱导型启动子B的抑制蛋白；第二质粒：含有诱导型启动子B、目的蛋白B和诱导型启动子A的抑制蛋白。在本专利技术的一种实施方式中，所述诱导型启动子A或B包括乳糖诱导型启动子、木糖诱导型启动子、阿拉伯糖诱导型启动子或四环素诱导型启动子中的任一种。在本专利技术的一种实施方式中，所述启动子A和启动子B为不同的启动子。在本专利技术的一种实施方式中，所述第一质粒以pHT01载体为出发载体，所述第二质粒以pBSG03载体为出发载体。在本专利技术的一种实施方式中，pBSG03载体的构建方法记载于文献GuanC,CuiW,ChengJ,etal.Constructionanddevelopmentofanauto-regulatorygeneexpressionsysteminBacillussubtilis[J].MicrobialCellFactories,2015,14(1):150。在本专利技术的一种实施方式中，所述第一质粒和第二质粒均切除了大肠杆菌转录复制子。在本专利技术的一种实施方式中，目的蛋白A或目的蛋白B包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、β-葡萄糖醛酸苷酶或β-半乳糖苷酶。本专利技术提供了一种生产目的蛋白的方法，将所述重组枯草芽孢杆菌作为发酵菌株，发酵生产蛋白。在本专利技术的一种实施方式中，在发酵环境中加入与第一质粒上诱导型启动子对应的诱导剂，启动第一质粒上目的蛋白的表达，并抑制第二质粒上的目的蛋白的表达。在本专利技术的一种实施方式中，在发酵环境中加入与第二质粒上诱导型启动子对应的诱导剂，启动第二质粒上目的蛋白的表达，并抑制第一质粒上的目的蛋白的表达。在本专利技术的一种实施方式中，在发酵环境中加入与第一质粒和第二质粒上诱导型启动子对应的诱导剂，同时诱导第一质粒和第二质粒上目的蛋白的表达。本专利技术提供了一种调控目的蛋白表达的方法，将所述重组枯草芽孢杆菌作为发酵菌株，通过添加相应诱导剂，诱导或抑制目的蛋白的表达。本专利技术还保护所述重组枯草芽孢杆菌，或所述方法在生产目的蛋白中的应用。有益效果：本专利技术构建了适用于双质粒转化的载体。省去了先在大肠杆菌中进行多拷贝复制，可直接进行枯草芽孢杆菌的转化，并且能够通过外源添加相应的诱导剂，诱导目的蛋白的表达。此系统表达效果稳定，以枯草芽孢杆菌为宿主，得到的产物安全无致病性，适用于多种生产场景。附图说明图1为pHTP43-sfGFP质粒图谱。图2为pHTminP43-sfGFP质粒图谱。图3为pBP43-mCherry质粒图谱。图4为pBminP43-mCherry质粒图谱。图5为穿梭版双质粒系统以及精简版的双质粒系统在枯草芽孢杆菌中的蛋白表达情况对比图。图6为乳糖诱导型启动子其质粒上还构建有木糖阻遏蛋白pHTPgrac-sfGFP-xylR。图7为木糖诱导型启动子带有乳糖阻遏蛋白pBPXylA-mCherry-lacI。图8为两种相互具有抑制效果的双质粒系统图。图9为含有双质粒系统的枯草芽孢杆菌在不同条件下蛋白表达情况图。具体实施方式1、sfGFP荧光强度的检测方法：样品12000×g离心2min，收集菌体，PBS缓冲液洗3次，用PBS稀释到一定浓度的菌体悬液，取200μL至96孔酶标板，放入SynergyTMH4荧光酶标仪检测荧光。激发光485nm，吸收光528nm，检测荧光。2、mcherry荧光强度的检测方法：样品12000×g离心2min，收集菌体，PBS缓冲液洗3次，用PBS稀释到一定浓度的菌体悬液，取200μL至96孔酶标板，放入SynergyTMH4荧光酶标仪检测荧光。激发光587nm，吸收光610nm，检测荧光。3、枯草芽孢杆菌168转化方法：挑单菌落枯草芽孢杆菌168接种至2mL的SPI培养基中，37℃摇床培养12-14h；从培养物中取100μL，接种至5mLSPI培养基中，37℃摇床培养4-5h后开始测OD600。当OD600约为1.0时，移取200μL菌液转接至2mL的SPII培养基中，于37℃、100r·min-1摇床孵育1.5h；向管中加入20μLl00×EGTA溶液，于37℃、100r·min-1摇床中培养10min后，每l.5mL离心管分装500μL；向管中加入经过测序验证正确的适量质粒，吹吸混匀放置于37℃、100r·min-1的摇床中培养2h；培养结束，吸取菌液约200μL均匀涂相应的选择性平板，37℃培养12-14h。4、PrimeSTARMAXDNA聚合酶(购自Takara，货号：R045Q)。5、2×GenRec重组试剂盒购自通用生物系统(安徽)有限公司，货号：CL08050。SPI培养基(20mL):表1SPI培养基组分表6、SP-ASaltsSolution(500mL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，含有双质粒系统，所述双质粒系统包含如下两种质粒：/n第一质粒：含有诱导型启动子A、目的蛋白A和诱导型启动子B的抑制蛋白；/n第二质粒：含有诱导型启动子B、目的蛋白B和诱导型启动子A的抑制蛋白；/n所述诱导型启动子A或启动子B分别为乳糖诱导型启动子、木糖诱导型启动子、阿拉伯糖诱导型启动子或四环素诱导型启动子中的任一种，且启动子A和启动子B为不同的启动子。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，含有双质粒系统，所述双质粒系统包含如下两种质粒：
第一质粒：含有诱导型启动子A、目的蛋白A和诱导型启动子B的抑制蛋白；
第二质粒：含有诱导型启动子B、目的蛋白B和诱导型启动子A的抑制蛋白；
所述诱导型启动子A或启动子B分别为乳糖诱导型启动子、木糖诱导型启动子、阿拉伯糖诱导型启动子或四环素诱导型启动子中的任一种，且启动子A和启动子B为不同的启动子。


2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述第一质粒以pHT01载体为出发载体，所述第二质粒以pBSG03载体为出发载体。


3.根据权利要求2所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述第一质粒和第二质粒均切除了大肠杆菌转录复制子。


4.根据权利要求1～3任一所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，目的蛋白A或目的蛋白B包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、β-葡萄糖醛酸苷酶或β-半乳糖苷酶。


5....

【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，崔文璟，陈巧青，刘中美，周丽，郭军玲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32