一种基因组编辑工具及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，尤其涉及一种基因组编辑工具及其应用。本发明专利技术的突变工具(enSc++)由广适Sc++基因在序列优化基础上进一步突变R221K/N404K两个关键功能位点进化而来，包含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。本发明专利技术提供的植物基因组编辑工具可以在保持编辑靶点广适性的前提下明显提高剪切效率。本发明专利技术利用所述工具获得了水稻基因编辑突变体。

【技术实现步骤摘要】
一种基因组编辑工具及其应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种基因组编辑工具及其应用。
技术介绍
基因组编辑系统CRISPR-Cas9已成为医学研究中的一种非常重要的工具，并且最终可能在农业、生物能源和食品安全等领域产生重大影响。CRISPR-Cas9可通过短的RNA片段(即向导RNA,gRNA)引导到基因组上的不同位点，然后利用一种称为Cas9的DNA切割酶随后在改位点进行所需的编辑。然而，尽管这种基因编辑工具取得了相当大的成功，但是它在基因组上能够访问的位点数量仍然是有限的。这是因为CRISPR-Cas9需要一种称为前间隔序列邻近基序(protospaceradjacentmotif，PAM)的特定DNA序列存在于基因组上的靶位点两侧，从而允许它识别靶位点。比如，作为一种最广泛使用的Cas9酶，来自酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的Cas9(SpCas9)的PAM序列为5′-NGG-3′。在这种PAM序列中，两个连续的碱基G的存在显著地限制了SpCas9能够靶向的位点数量，仅占基因组上的大约9.9％的位点，靶向区域十分局限。现有技术中发现一种最成功的酶为来自犬链球菌(Streptococcuscanis)的Cas9(ScCas9)，它与已经广泛使用的SpCas9酶非常相似。ScCas9是基础版SpCas9的变体，两者的氨基酸序列非常相似，但是它能够靶向SpCas9不能够靶向的靶DNA序列。ScCas9的PAM序列为5′-NNG-3′。在这种PAM序列中，仅存在一个碱基G，这就允许ScCas9要比SpCas9靶向基因组中更多的位点：占基因组中将近一半的位点。此外，ScCas9使用与SpCas9相同的gRNA。但ScCas9在植物基因编辑中效率相对偏低，基因组很多位点无法稳定编辑，因此对ScCas9及其衍生变体开展进一步效率优化，开发更加广适高效的植物基因组编辑工具十分必要。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种基因组编辑工具及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。本专利技术是这样实现的，一种基因组编辑工具，其特征在于：包含如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列或SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的同源序列；所述核苷酸序列由广适Sc++基因在序列优化基础上进一步突变R221K/N404K两个关键功能位点进化而来。如上述的基因组编辑工具在基因组编辑中的应用。进一步地，包括制备包含如权利要求1所述基因组编辑工具的表达载体、表达盒、打靶载体或转基因细胞中的至少一种。进一步地，载体包括PUC57-AMP或pHUN400。进一步地，包括在植物基因组编辑中的应用。进一步地，所述植物包括单子叶植物。进一步地，所述单子叶植物包括水稻。进一步地，所述水稻包括粳稻。进一步地，所述粳稻优选为粳稻日本晴。一种植物基因组编辑方法，包括：将包含如上述的核苷酸序列的片段与载体连接，获取包含编辑工具的植物表达载体；将向导RNA的表达框与包含编辑工具的植物表达载体连接，获取包含sgRNA表达框的植物表达载体；选择包括NNG特征的PAM序列的靶位点序列，其中，N为A,T,G或C；根据靶位点合成正、反向寡核苷酸链，退火形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的插入片段；将插入片段与包含sgRNA表达框的植物表达载体连接，获得重组载体，并提取重组载体质粒；将重组载体质粒转入植物细胞，对植物基因组进行编辑。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术的突变工具(enSc++)由广适Sc++基因在序列优化基础上进一步突变R221K/N404K两个关键功能位点进化而来，包含SEQIDNo：1所示的核苷酸序列。本专利技术提供的植物基因组编辑工具可以在保持编辑靶点广适性的前提下明显提高剪切效率。本专利技术利用所述工具获得了水稻基因编辑突变体。附图说明图1是PHUN4C11载体质粒示意图；图2是实施例3构建的转基因植株中本专利技术的enSc++产生的靶向突变。WT表示未突变的序列，划横线部分为PAM序列，d表示缺失，i表示插入，数字表示碱基个数。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本专利技术的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本专利技术的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本专利技术的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本专利技术实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。为了更好地理解本专利技术而不是限制本专利技术的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本专利技术中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。本专利技术下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。本专利技术中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。本专利技术披露了一种基因组编辑工具及其应用。本专利技术根据Sc++氨基酸序列设计了适于水稻的核酸序列，进一步导入了R221K/N404K双突变，从而提供一种广适高效的enSc++基因，所述广适高效的enSc++基因具有SEQIDNo：1所示的核苷酸序列。本专利技术还需要说明的是，本专利技术所述的“具有SEQIDNo：1所示的核苷酸序列”并非是指任意的含有除SEQIDNo：1所示的核苷酸序列以外的核苷酸或核苷酸序列，而是指根据本领域技术人员的常规手段，为了便于或有利于对SEQIDNo：1所示的核苷酸序列进行操作或实现SEQIDNo：1所示的核苷酸序列的复制等而含有的不影响其功能发挥的核苷酸或核苷酸序列，例如，酶切位点、标记基因、筛选基因等。因此，本专利技术所述的“具有SEQIDNo：1所示的核苷酸序列”是指具有SEQIDNo：1所示的核苷酸序列，但仍然能够实现SEQIDNo：1所示的核苷酸序列功能的序列。本专利技术中表达载体的构建方法可以按照本领域常规的方法进行，例如，使用相同的限制性内切酶对EnSc++基因和待插入的载体进行酶切，然后再使用连接酶将EnSc++基因连接到载体中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因组编辑工具，其特征在于：包含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列的同源序列；所述核苷酸序列由广适Sc++基因在序列优化基础上进一步突变R221K/N404K两个关键功能位点进化而来。/n

【技术特征摘要】
1.一种基因组编辑工具，其特征在于：包含如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列或SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的同源序列；所述核苷酸序列由广适Sc++基因在序列优化基础上进一步突变R221K/N404K两个关键功能位点进化而来。


2.如权利1所述的基因组编辑工具在基因组编辑中的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：包括制备包含如权利要求1所述基因组编辑工具的表达载体、表达盒、打靶载体或转基因细胞中的至少一种。


4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：载体包括PUC57-AMP或pHUN400。


5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：包括在植物基因组编辑中的应用。


6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述植物包括单子叶植物。


7.根据权利要求6所述的应...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴丹丹，纪春，张晶，郑凯丽，许敏敏，陈彩霞，
申请(专利权)人：合肥戬谷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34