从植物中大量生产碳酸酐酶的方法技术

本发明专利技术涉及用于从植物中生产及分离纯化碳酸酐酶的重组载体的设计及利用该重组蛋白质的纤维素结合模块3域的纤维素珠(cellulose bead)结合性质来分离纯化包含从植物中生产的碳酸酐酶的重组蛋白质的方法和借助利用纤维素结合模块3来坚固地固定于纤维素珠的表面的状态的碳酸酐酶诱导二氧化碳的水合反应的方法。

【技术实现步骤摘要】
从植物中大量生产碳酸酐酶的方法
本申请将2019年3月22日申请的韩国专利申请第10-2019-0032749号作为优先权来主张，上述说明书全文为本申请的参考文献。本专利技术涉及从植物中大量生产碳酸酐酶以及利用其来应用于二氧化碳的水合反应的方法。
技术介绍
碳酸酐酶(Carbonicanhydrase)使二氧化碳水合于水中或从重碳酸盐离子中执行脱水反应。碳酸酐酶在活性部位具有锌(Zinc)金属离子，从而被称之为金属化酶。碳酸酐酶可应用于特异性地捕集CO2。当将碳酸酐酶同时使用于甲基二乙醇胺(MDEA)时，呈现比单独使用甲基二乙醇胺时更高的CO2捕集活性。并且，对回收捕集于甲基二乙醇胺(MEDA)溶液的CO2有效。碳酸酐酶可从包含CO2的混合气体中单纯地捕集CO2来仅回收CO2。当前，正在开发利用作为胺系列的化合物的甲基二乙醇胺(MDEA，methyldiethanolamine)或Ni-MOF-74之类的膜来从排放气体中捕集CO2或通过加压摆动吸附(PSA，pressurizationswingingadsorption)工艺从包含CO2的混合气体中单纯地仅纯化CO2的技术。为了应用于CO2的捕集，必须要以低费用大量生产碳酸酐酶，并将其纯化来使用。当在甲基二乙醇胺(MEDA)溶液中包含碳酸酐酶来使用时，利用大肠杆菌来生产DvCA碳酸酐酶(来源于普通脱硫弧菌(Desulfovibriovulgaris)的CAH)，并不进行分离纯化，而直接使用包含碳酸酐酶的大肠杆菌。分子生物学和遗传工学技术的飞速发展还适用于植物领域，从而不断努力从植物体中生产有用生理活性物质。当从植物中生产有用物质时，具有如下优点：可大大减少生产成本，可从根本上排除在以往的动物细胞或微生物中合成来分离纯化蛋白质的方法中有可能产生的病毒、癌症基因、肠毒素之类的多种污染源，在商品化步骤中也与动物细胞或微生物不同，可利用种子来长期进行保管及管理。并且，当相应的有用物质的需求急增时，在大量生产所需的设备技术或费用方面，比现有的动物细胞系统绝对有利，因而可根据在最短期间内提高的需求进行供给，这也是优点。但是，即使有这种优点，其最大缺点在于，当从植物细胞中生产蛋白质时，表达与包含动物细胞的其他宿主相比相对低的蛋白质，并难以进行分离纯化。对其有很多研究，作为多种方法，试图在植物细胞中增加蛋白质表达量，并有效分离纯化蛋白质。当利用植物时，有如下方法：利用转化体来生产蛋白质的方法、利用由农杆菌介导的转化来在植物中过度诱导蛋白质的表达，并由此生产蛋白质的方法等。例如，在韩国公开专利号第10-2018-0084680号中公开有用于植物细胞中表达目的蛋白质的重组载体，在韩国公开号第10-2017-0131207号中公开有利用RbcS融合蛋白质来从植物中高表达目的蛋白质的方法及利用目的蛋白质表达植物体的医疗用蛋白质的口服给药用组合物的制备方法。当利用转化体时，应用利用整个植物来在叶子或种子之类的特定组织中生产蛋白质的方法、从转化体中诱导细胞株(cellline)来生产蛋白质的方法。虽然通过由农杆菌介导的转化的方法迅速且表达水平也高，但相比于包括培养农杆菌并通过真空进行浸润的步骤等利用转化植物，工序更复杂。在本专利技术中，为了在植物中容易分离纯化碳酸酐酶而锐意努力，其结果，确认到当将纤维素结合模块3(CBM3)、小泛素相关修饰物(SUMO)及M域融合于作为碳酸酐酶的GcCAHα3或SazCA时，可在植物中容易生产碳酸酐酶，并利用其来进行分离纯化，并且，利用固定于纤维素珠的表面的碳酸酐酶应用于二氧化碳的水合反应来进行确认，从而完成本专利技术。
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术的目的在于，提供用于从植物中生产碳酸酐酶的重组载体。本专利技术的再一目的在于，提供转化为上述重组载体的转化体。本专利技术的另一目的在于，提供包括以下步骤的从植物中生产碳酸酐酶的方法。步骤(a)，制备上述描述的重组载体；步骤(b)，将上述重组载体导入细胞来制备转化体；步骤(c)，培养上述转化体；步骤(d)，将上述培养物浸润于植物；以及步骤(e)，粉碎上述植物来与纤维素珠相结合。本专利技术的还一目的在于，提供包含上述描述的碳酸酐酶的二氧化碳捕集用组合物。本专利技术的又一目的在于，提供包括向上述二氧化碳捕集用组合物供给二氧化碳的步骤的捕集二氧化碳的方法。本专利技术的又一目的在于，提供包含上述描述的碳酸酐酶的二氧化碳游离用组合物。本专利技术的又一目的在于，提供包括向上述描述的二氧化碳游离用组合物供给包含CO3的化合物的步骤的游离二氧化碳的方法。用于解决问题的方案为了解决上述的问题，本专利技术可提供用于从植物中生产碳酸酐酶的重组载体，其包括：(i)M域；(ii)小泛素相关修饰物(SUMO，asmallubiquitin-relatedmodifier)；(iii)碳酸酐酶；以及(iv)纤维素结合模块3(CBM3，Cellulose-bindingmodule3)。根据本专利技术的一优选实施例，上述碳酸酐酶可来源于硫脲氢祖蓝(Sulfurihydrogenibiumazorense)或绳状龙须菜(Gracilariopsischorda)。根据本专利技术的再一优选实施例，来源于上述绳状龙须菜(Gracilariopsis)的碳酸酐酶的基因序列可包含对序列号1的氨基酸序列进行编码的碱基序列，来源于上述硫脲氢祖蓝的碳酸酐酶的基因序列可包含对序列号11的氨基酸序列进行编码的碱基序列。根据本专利技术的另一优选实施例，来源于上述绳状龙须菜(Gracilariopsis)的碳酸酐酶的基因序列可包含序列号2的碱基序列，来源于上述硫脲氢祖蓝的碳酸酐酶的基因序列可包含序列号12的碱基序列。根据本专利技术的还一优选实施例，上述M域的基因序列可位于小泛素相关修饰物的N-末端前。根据本专利技术的又一优选实施例，上述M域可分别位于小泛素相关修饰物的N-末端前及纤维素结合模块3的N-末端前。根据本专利技术的又一优选实施例，上述M域的基因序列可包含对序列号5的氨基酸序列进行编码的碱基序列。根据本专利技术的又一优选实施例，上述M域的基因序列可包含序列号6的碱基序列。根据本专利技术的又一优选实施例，上述小泛素相关修饰物的基因可包含序列号7的碱基序列。根据本专利技术的又一优选实施例，上述纤维素结合模块3(CBM3，cellulose-bindingmodule3)的基因可包含序列号7的碱基序列。并且，在本专利技术中，上述重组载体还可包含选自由来源于花椰菜花叶病毒(cauliflowermosaicvirus)的35S启动子、来源于花椰菜花叶病毒的19S核糖核酸(RNA)启动子、植物的肌动蛋白蛋白质启动子及泛素蛋白质启动子组成的组中的一种启动子。本专利技术还可提供转化为上述重组载体的转化体。根据本专利技术的一优选实施例，上述转化体可以为农杆菌(Agrobacterium)。本专利技术还可提供包括以下步骤的从植物中生产碳酸酐本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于从植物中生产碳酸酐酶的重组载体，其特征在于，包含：/n(i)M域；/n(ii)小泛素相关修饰物；/n(iii)碳酸酐酶；以及/n(iv)纤维素结合模块3。/n

【技术特征摘要】
20190322 KR 10-2019-00327491.一种用于从植物中生产碳酸酐酶的重组载体，其特征在于，包含：
(i)M域；
(ii)小泛素相关修饰物；
(iii)碳酸酐酶；以及
(iv)纤维素结合模块3。


2.根据权利要求1所述的用于从植物中生产碳酸酐酶的重组载体，其特征在于，上述碳酸酐酶来源于绳状龙须菜或硫脲氢祖蓝。


3.根据权利要求2所述的用于从植物中生产碳酸酐酶的重组载体，其特征在于，来源于上述绳状龙须菜的碳酸酐酶的基因序列包含对序列号1的氨基酸序列进行编码的碱基序列，来源于上述硫脲氢祖蓝的碳酸酐酶的基因序列包含对序列号11的氨基酸序列进行编码的碱基序列。


4.根据权利要求3所述的用于从植物中生产碳酸酐酶的重组载体，其特征在于，来源于上述绳状龙须菜的碳酸酐酶的基因序列包含序列号2的碱基序列，来源于上述硫脲氢祖蓝的碳酸酐酶的基因序列包含序列号12的碱基序列。


5.根据权利要求1所述的用于从植物中生产碳酸酐酶的重组载体，其特征在于，上述M域的基因序列位于小泛素相关修饰物的N-末端前。


6.根据权利要求1所述的用于从植物中生产碳酸酐酶的重组载体，其特征在于，上述M域分别位于小泛素相关修饰物的N-末端前及纤维素结合模块3的N-末端前。


7.根据权利要求5或6所述的用于从植物中生产碳酸酐酶的重组载体，其特征在于，上述M域的基因序列包含对序列号5的氨基酸序列进行编码的碱基序列。


8.根据权利要求5或6所述的用于从植物中生产碳酸酐酶的重组载体，其特征在于，上述M域的基因序列包含序列号6的碱基序列。


9.根据权利要求1所述的用于从植物中生产碳酸酐酶的重组载体，其特征在于，上述小泛素相关...

【专利技术属性】
技术研发人员：黃仁煥，阿卜杜尔·拉扎克姆德，柳鳳烈，李東昱，李俊鎬，马都·库马里，
申请(专利权)人：生物伙伴公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR