一种针对甘蔗的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种针对甘蔗的CRISPR/Cas9载体，由序列如SEQ ID NO.2所示pUC57‑simple‑sgRNA载体HindIII酶切后的片段与CPB‑ZmUbi‑hspCas9载体HindIII酶切后的片段连接而成。本发明专利技术首次构建了针对甘蔗的CRISPR/Cas9载体，能够快速简单地对甘蔗基因进行高效的定点突变，实现特定位点的定向基因编缉，从而造成目的基因序列永久的缺失，为甘蔗基因功能的研究及利用分子育种技术来培育新品种提供技术支撑，而且本申请直接采用化学合成的方法构建sgRNA的DNA序列，能够快速、方便完成的CRISPR‑Cas9系统构建，促进甘蔗基因编辑系统的开发与应用。

【技术实现步骤摘要】
一种针对甘蔗的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用
本专利技术属于基因工程，具体其涉及一种针对甘蔗的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。
技术介绍
基因组编辑技术CRISPR/Cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPRassociated9)系统，主要包含单向导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白。Cas9和sgRNA形成一个复合物，成功表达的sgRNA通过自身的Cas9把手(Cas9handle)与Cas9蛋白形成复合体；然后，复合体开始搜寻并匹配PAM(主要为NGG)序列,随后sgRNA的碱基互补配对区序列通过碱基互补配对原则识别目标记的靶标序列，Cas9蛋白利用自身的核酸内切酶活性对靶序列进行切割,形成DNA双链断裂(double-strandbreak,DSB)，产生可位点特异性DNA改变。2013年,CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞建立后,便迅速在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、烟草(Nicotianabenthamiana)等模式植物的原生质体、外植体和叶片组织中应用，之后CRISPR/Cas9系统便迅速在二倍体植物水稻、玉米(Zeamays)、大麦(Hordeumvulgare)、马铃薯(Solanumtuberosum)、以及多倍体植物棉花(Gossypiumhirsutum)、小麦(Triticumaestivum)油菜(Brassicanapus)等中实现了可遗传的基因编辑,并在研究过程中对CRISPR/Cas9系统的靶基因的特异性、突变效率等方面进行了优化和应用。甘蔗是我国第一大热带作物，我国食糖的总产量80％来源与甘蔗，甘蔗为异源多倍体植株(水稻、玉米为二倍体)，基因拷贝数多，基因冗余严重，甘蔗基因组编辑平台由于其多倍性和遗传转化效率低而落后于其它作物植物。为了更好进行功能基因组学和分子育种研究，建立准确的定点突变甘蔗株系显得非常必要，目前尚无关于甘蔗的定点突变的系统，因此建立高效的针对甘蔗的CRISPR/Cas9系统并将其应用于甘蔗的基因编辑系统显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种针对甘蔗的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。本专利技术的第一个方面是提供一种针对甘蔗的CRISPR/Cas9载体，其含有Cas9表达序列以及sgRNA的DNA序列，由pUC57-simple-sgRNA载体HindIII酶切后的片段与CPB-ZmUbi-hspCas9载体HindIII酶切后的片段连接而成，其中，所述sgRNA的DNA序列如SEQIDNO:1所示，所述pUC57-simple-sgRNA载体的序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第二个方面是提供一种如本专利技术第一个方面所述的CRISPR/Cas9载体的构建方法，包括以下步骤：(1)设计特异sgRNA的DNA序列，如SEQIDNO.1所示，通过固相亚磷酸胺三酯法合成SEQIDNO.1所示片段；(2)将步骤(1)通过化学合成的方法一步获得的sgRNA的DNA片段克隆到pUC57-simple，获得pUC57-simple-sgRNA载体，序列如SEQIDNO.2所示；(3)利用HindIII对pUC57-simple-sgRNA酶切，回收含有sgRNA的DNA序列的片段；利用HindIII对CPB-ZmUbi-hspCas9酶切，回收含有CPB-ZmUbi-hspCas9线性化载体片段；(4)将步骤(3)获得的两片段进行连接得到含有特异性靶目标序列的sgRNA的CPB-ZmUbi-hspCas9-CTC1920载体。其中，通过固相亚磷酸胺三酯法合成SEQIDNO.1所示片段具体如下：首先将欲合成的寡核苷酸链3′末端核苷(N1)以其3’-OH通过1个长的烷基臂与固相载体耦联，N1的5’-OH以二甲氧基三苯甲基(DMTr)保护；然后通过苯磺酸处理带有保护基的核苷，去除5’末端的DMTr，暴露出5’-OH，5’-OH碱基和下个碱基的3’-OH形成亚磷酸三酯，通过碘氧化成磷酸三酯，获得第二个碱基，加入二氯乙酸除去第二个碱基5’-OH上的保护剂DMTr，进行第三个碱基合成，通过循环此步骤，获得目的片段。本专利技术的第三个方面是提供在针对甘蔗的CRISPR/Cas9系统特异性敲除甘蔗ShPDS基因中用于特异性靶向甘蔗ShPDS基因的sgRNA，所述sgRNA的DNA序列如SEQIDNO:1所示，所述甘蔗ShPDS基因的序列如SEQIDNO:7所示。本专利技术的第四个方面是提供如本专利技术的第一个方面所述的CRISPR/Cas9载体、或者如本专利技术的第三个方面所述的sgRNA在特异性敲除甘蔗ShPDS基因中的应用，所述甘蔗ShPDS基因的序列如SEQIDNO:7所示。本专利技术的第五个方面是提供如本专利技术的第一个方面所述的CRISPR/Cas9载体、或者如本专利技术的第三个方面所述的sgRNA在制备ShPDS基因突变的转基因甘蔗中的应用，所述甘蔗ShPDS基因的序列如SEQIDNO:7所示。本专利技术的第六个方面是提供如本专利技术的第一个方面所述的CRISPR/Cas9载体、或者如本专利技术的第三个方面所述的sgRNA在制备株植生长缓慢，植株矮小的转基因甘蔗中的应用。本专利技术的第七个方面是提供一种转基因甘蔗的制备方法，采用如本专利技术的第一个方面所述的CRISPR/Cas9载体转染农杆菌，然后再侵染甘蔗愈伤组织，培养，得到转基因甘蔗。优选地，所述制备方法包括以下步骤：(1)将本专利技术的第一个方面所述的CRISPR/Cas9载体载体农杆菌，挑取阳性单克隆于YEP液体培养基中28℃、180r/min摇过夜，次日再取少量菌液加入新鲜的YEP液体培养基中28℃、180r/min摇至OD600约0.3，离心去上清，将菌体用含有浓度为100μm/mL的乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬，在于90rpm/min的摇床上摇1小时，活化菌种，用于下一步的愈伤侵染；其中，所述YEP液体培养基中含有利福平50ng/mL、卡那霉素70ng/mL、乙酰丁香酮100μm/mL；(2)将培养好的甘蔗愈伤组织，用尖头小镊子收集至带有灭菌滤纸的无菌培养皿中，约3-5g，超净台中吹干，后放入步骤(2)的侵染液中，抽真空30min，低速振荡10min；(3)侵染结束后，去掉侵染液，用漏勺收集愈伤，并置于有灭菌滤纸的无菌培养皿中，超净台中吹干，并于22℃暗培养3天；(4)将步骤(3)中的侵染后的愈伤组织置于愈伤诱导培养基上进行愈伤暗培养及抗性筛选，所述愈伤诱导培养基的配方为：每升含有特美汀为150mg、1.5mg2,4-D、1.5mgPPT、琼脂6.9g，其余为MS培养基；(5)筛选步骤(4)中依然存活的愈伤小块接入分化培养基中继续抗性筛选及光照分化出苗；所述分化培养基的配方为：每升含有特美汀为150mg、6-BA1.5mg、PPT1.5mg，其余本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对甘蔗的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，其含有Cas9表达序列以及sgRNA的DNA序列，由pUC57-simple-sgRNA载体HindIII酶切后的片段与CPB-ZmUbi-hspCas9载体HindIII酶切后的片段连接而成，其中，所述sgRNA的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述pUC57-simple-sgRNA载体的序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种针对甘蔗的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，其含有Cas9表达序列以及sgRNA的DNA序列，由pUC57-simple-sgRNA载体HindIII酶切后的片段与CPB-ZmUbi-hspCas9载体HindIII酶切后的片段连接而成，其中，所述sgRNA的DNA序列如SEQIDNO:1所示，所述pUC57-simple-sgRNA载体的序列如SEQIDNO.2所示。


2.一种如权利要求1所述的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计特异sgRNA的DNA序列，如SEQIDNO.1所示，通过固相亚磷酸胺三酯法合成SEQIDNO.1所示片段；
(2)将步骤(1)通过化学合成的方法一步获得的sgRNA的DNA片段克隆到pUC57-simple，获得pUC57-simple-sgRNA载体，序列如SEQIDNO.2所示；
(3)利用HindIII对pUC57-simple-sgRNA酶切，回收含有sgRNA的DNA序列的片段；利用HindIII对CPB-ZmUbi-hspCas9酶切，回收含有CPB-ZmUbi-hspCas9线性化载体片段；
(4)将步骤(3)获得的两片段进行连接得到含有特异性靶目标序列的sgRNA的CPB-ZmUbi-hspCas9-CTC1920载体。


3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，通过固相亚磷酸胺三酯法合成SEQIDNO.1所示片段具体如下：
首先将欲合成的寡核苷酸链3′末端核苷(N1)以其3’-OH通过1个长的烷基臂与固相载体耦联，N1的5’-OH以二甲氧基三苯甲基保护；
然后通过苯磺酸处理带有保护基的核苷，去除5’末端的DMTr，暴露出5’-OH，5’-OH碱基和下个碱基的3’-OH形成亚磷酸三酯，通过碘氧化成磷酸三酯，获得第二个碱基，加入二氯乙酸除去第二个碱基5’-OH上的保护剂DMTr，进行第三个碱基合成，通过循环此步骤，获得目的片段。


4.在针对甘蔗的CRISPR/Cas9系统特异性敲除甘蔗ShPDS基因中用于特异性靶向甘蔗ShPDS基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的DNA序列如SEQIDNO:1所示，所述甘蔗ShPDS基因的序列如SEQIDNO:7所示。


5.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9载体、或者如权利要求4所述的sgRNA在特异性敲除甘蔗ShPDS基因中的应用，所述甘蔗ShPDS基因的序列如SEQIDNO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：王俊刚，王文治，赵婷婷，张树珍，冯翠莲，沈林波，冯小艳，熊国如，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：海南;46