一种苜蓿花叶病毒的侵染性克隆、重组农杆菌及构建方法技术

一种苜蓿花叶病毒的侵染性克隆、重组农杆菌及构建方法，属于植物基因工程技术领域。为了提高侵染性克隆侵染效率，本发明专利技术提供了一种苜蓿花叶病毒的侵染性克隆，所述侵染性克隆载体由苜蓿花叶病毒全基因组与含有CaMV 35S启动子和HDV核酶Rz的植物表达载体pCB301‑2μ‑HDV重组后获得的。所述侵染性克隆由下述三个载体组成：携带苜蓿花叶病毒基因组RNA1的重组载体pCB301‑AMVRNA1、携带苜蓿花叶病毒基因组RNA2的重组载体pCB301‑AMVRNA2和携带苜蓿花叶病毒基因组RNA3的重组载体pCB301‑AMVRNA3。本发明专利技术能够节省病毒侵染时间，提高的侵染的成功率。

【技术实现步骤摘要】
一种苜蓿花叶病毒的侵染性克隆、重组农杆菌及构建方法
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种苜蓿花叶病毒的侵染性克隆、重组农杆菌及构建方法。
技术介绍
植物病毒侵染性克隆是植物病毒学研究领域的基础研究工具。克隆后的病毒基因组易于进行突变、重组等分子操作，在植物病毒的基因功能，侵染机制，植物抗病毒机制等方面具有重要的作用。此外，植物病毒的侵染性克隆也可作为基因表达或沉默的载体，进行植物基因功能的研究，或者进行外源蛋白的表达。目前有许多植物病毒的侵染性克隆被构建，例如：燕飞，郑红英，肖彩利，韩科雷，鲁宇文，林林，陈剑平，黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体和农杆菌菌株及其制备方法和应用(CN104498521A)；宋震，崔甜甜，宾羽，晏建红，李中安，周常勇，三元穿梭载体及利用其构建CLBV侵染性克隆的方法(CN108559759A)；余乃通，刘志昕，刘锋，瞿玲，笈小龙，郑贤欣，一种香蕉束顶病毒侵染性克隆及构建方法(CN107488673A)；田延平，王健，李向东，耿超，马铃薯卷叶病毒侵染性克隆及其构建方法(CN109797162A)，等。苜蓿花叶病毒(Alfalfamosaicvirus，AMV)属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)苜蓿花叶病毒属(Alfamovirus)，是该属的代表种。该病毒寄主范围广，能侵染51个科的430种双子叶植物，常见的包括苜蓿、三叶草、马铃薯、菜豆、豇豆、赤豆、大豆、绿豆、豌豆、蚕豆、菜豆、烟草、辣椒等。该病毒通过20多种蚜虫以非持久方式进行传播，也可通过汁液摩擦、嫁接和种子传播；其中，带毒种子是远距离传播的主要途径。该病毒主要引起植物叶片黄化或花叶、偶见皱缩和植株矮化的症状，侵染后可严重影响作物的光合作用，造成严重的经济损失。AMV的基因组是3条正义单链RNA(positive-sense，single-strandedRNA，ssRNA)，分别命名为RNA1、RNA2和RNA3。RNA1、RNA2和RNA3的5′端都含有甲基化的帽子(m7G5′ppp5′Gp)，但3′端没有细胞信使RNA(mRNA)类似的多聚腺苷酸尾巴(poly-A)，而存在一个转运RNA(tRNA)类似的结构。RNA1和RNA2含有一个开放阅读框(Openreadingframe，ORF)，分别编码约126kDa的1a蛋白和约90kDa的2a蛋白；1a蛋白和2a蛋白组成病毒的RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRp)，参与病毒基因组的复制以及亚基因组的转录。RNA3含有2个ORF，分别编码约32kDa的运动蛋白(Movementprotein，MP)和约24kDa的外壳蛋白(Coatprotein，CP)。MP通过RNA3直接翻译，而CP通过亚基因组RNA4表达。该病毒的侵染性克隆没有相关专利，但是已有文献报道：Sanchez-NavarroJ,MiglinoR,RagozzinoA,BolJF.EngineeringofAlfalfamosaicvirusRNA3intoanexpressionvector,ArchivesofVirology,2001,146:923-939；VoltAC,NeelemanL,LinthorstHJM,BolJF.Roleofthe3′-UntranslatedRegionsofAlfalfaMosaicVirusRNAsintheFormationofaTransientlyExpressedReplicaseinPlantsandintheAssemblyofVirions,JournalofVirology,2001,75:6440-6449.其中，Sanchez-Navarro等人构建的苜蓿花叶病毒侵染性克隆将该病毒的RNA1、RNA2和RNA3分别插入到原核生物T7启动子下游，通过体外转录的方法获得病毒的基因组RNA，再通过机械摩擦接种植物或者PEG法转染植物原生质体，而Volt等人构建的苜蓿花叶病毒侵染性克隆将该病毒的RNA1、RNA2和RNA3分别插入到植物双元表达载体的花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaicvirus，CaMV)的35S启动子和胭脂氨酸合成酶(NOS)的终止子之间，通过农杆菌介导法侵染植物。但上述研究存在如下缺陷：Sanchez-Navarro等人构建的苜蓿花叶病毒侵染性克隆接种植物不方便，而且RNA植物摩擦植物的成功率低，而Volt等人构建的苜蓿花叶病毒侵染性克隆虽然跳过了体外转录的过程，但是该侵染性克隆在植物细胞内转录后在病毒RNA后会增加一段额外的NOS序列以及多聚A尾巴(PolyA)，造成侵染率下降。此外，Volt等人构建的苜蓿花叶病毒侵染性克隆的构建过程需要有一个体外的DNA连接反应和大肠杆菌繁殖的过程，增加了时间成本，同时由于一些病毒的基因组对大肠杆菌具有毒性作用，可能引进插入的病毒基因组中出现片段的缺失或突变，造成构建失败。
技术实现思路
为了提高侵染性克隆侵染效率，本专利技术提供了一种苜蓿花叶病毒的侵染性克隆，所述侵染性克隆由苜蓿花叶病毒全基因组与含有CaMV35S启动子和HDV核酶Rz的植物表达载体pCB301-2μ-HDV重组后获得的；所述苜蓿花叶病毒全基因组由RNA1、RNA2和RNA3组成，所述RNA1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述RNA2的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，所述RNA3的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；所述侵染性克隆由下述三个载体组成：携带苜蓿花叶病毒基因组RNA1的重组载体pCB301-AMVRNA1、携带苜蓿花叶病毒基因组RNA2的重组载体pCB301-AMVRNA2和携带苜蓿花叶病毒基因组RNA3的重组载体pCB301-AMVRNA3。本专利技术还提供了含有上述的侵染性克隆载体的侵染性重组农杆菌。本专利技术还提供了上述侵染性克隆的构建方法，包括如下步骤：(1)提取含有苜蓿花叶病毒的大豆叶片总RNA，反转录得到苜蓿花叶病毒的cDNA；以所述cDNA为模板，通过PCR方法分段扩增，分别获得苜蓿花叶病毒基因组的RNA1、RNA2和RNA3；(2)将植物表达载体pCB301-2μ-HDV线性化处理，得到线性化pCB301-2μ-HDV载体；(3)同源重组：将所述线性化pCB301-2μ-HDV载体分别与步骤1)获得的RNA1、RNA2和RNA3等质量浓度比例混合，转化酵母菌得到重组酵母菌，筛选后提取质粒，分别获得含有RNA1的重组酵母质粒pCB301-AMVRNA1、含有RNA2的重组酵母质粒pCB301-AMVRNA2和含有RNA3的重组酵母质粒pCB301-AMVRNA3；质粒pCB301-AMVRNA1、质粒pCB301-AMVRNA2和质粒pCB301-AMVRNA3的组合即为苜蓿花叶病毒侵染性克隆。本专利技术还提供了上述侵染性克隆的侵染性重组农杆菌的构建方法，将上述获得的重组酵母质粒pCB301-AMVRNA1、重组酵母质粒pCB301-AMVRNA2和重组酵母质粒pCB301本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种苜蓿花叶病毒的侵染性克隆，其特征在于，所述侵染性克隆由苜蓿花叶病毒全基因组与含有CaMV 35S启动子和HDV核酶Rz的植物表达载体pCB301-2μ-HDV重组后获得的；所述苜蓿花叶病毒全基因组由RNA1、RNA2和RNA3组成，所述RNA1的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，所述RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述RNA3的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示；所述侵染性克隆由下述三个载体组成：携带苜蓿花叶病毒基因组RNA1的重组载体pCB301-AMVRNA1、携带苜蓿花叶病毒基因组RNA2的重组载体pCB301-AMVRNA2和携带苜蓿花叶病毒基因组RNA3的重组载体pCB301-AMVRNA3。/n

【技术特征摘要】
1.一种苜蓿花叶病毒的侵染性克隆，其特征在于，所述侵染性克隆由苜蓿花叶病毒全基因组与含有CaMV35S启动子和HDV核酶Rz的植物表达载体pCB301-2μ-HDV重组后获得的；所述苜蓿花叶病毒全基因组由RNA1、RNA2和RNA3组成，所述RNA1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述RNA2的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，所述RNA3的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；所述侵染性克隆由下述三个载体组成：携带苜蓿花叶病毒基因组RNA1的重组载体pCB301-AMVRNA1、携带苜蓿花叶病毒基因组RNA2的重组载体pCB301-AMVRNA2和携带苜蓿花叶病毒基因组RNA3的重组载体pCB301-AMVRNA3。


2.一种含有权利要求1所述的侵染性克隆的侵染性重组农杆菌。


3.权利要求1所述的侵染性克隆的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取含有苜蓿花叶病毒的大豆叶片总RNA，反转录得到苜蓿花叶病毒的cDNA；以所述cDNA为模板，通过PCR方法分段扩增，分别获得苜蓿花叶病毒基因组的RNA1、RNA2和RNA3；
(2)将植物表达载体pCB301-2μ-HDV线性化处理，得到线性化pCB301-2μ-HDV载体；
(3)同源重组：将所述线性化pCB301-2μ-HDV载体分别与步骤1)获得的RNA1、RNA2和RNA3等摩尔比例混合，转化酵母菌得到重组酵母菌，筛选后提取质粒，分别获得含有RNA1的重组酵母质粒pCB301-AMVRNA1、含有RNA2的重组酵母质粒pCB301-AMVRNA2和含有RNA3的重组酵母质粒pCB301-AMVRNA3；质粒pCB301-AMVRNA1、质粒pCB301-AMVRNA2和质粒pCB301-AMVRNA3的组合即为苜蓿花叶病毒侵染性克隆。


4.权利要求2所述的侵染性重组农杆菌的构建方法，其特征在于，将权利要求3中获得的重组酵母...

【专利技术属性】
技术研发人员：程晓非，武晓云，车欣洋，刘佳慧，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23