一种利用转基因技术培育短蔓花期延迟西瓜新种质的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用转基因技术培育短蔓花期延迟西瓜新种质的方法，本发明专利技术还涉及构建RNAi的方法，具体通过用DHpart27RNAiFADp1P4载体构建含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的重组干扰载体，然后采用农杆菌介导法将构建的RNAi载体转化西瓜，筛选得到短蔓、花期延迟的西瓜新种子，本发明专利技术首次公开利用转基因方法成功得到具短蔓、花期推迟并且西瓜品质优的种质资源的技术，并且得到的短蔓西瓜，短蔓程度更高，在实际应用中能够更加节约土地资源。

【技术实现步骤摘要】
一种利用转基因技术培育短蔓花期延迟西瓜新种质的方法
本专利技术属于植物转基因
，尤其是涉及一种利用转基因技术培育短蔓花期延迟西瓜新种质的方法，本专利技术还涉及构建RNAi的方法。
技术介绍
转基因技术是一种新型的育种手段，弥补了传统育种技术过程中盲目性大，生长周期长的不足。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)，又称转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)，是指将特异性同源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内，使目的基因的不表达或表达水平下降。RNAi技术可广泛应用到包括功能基因组学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等。矮化是植物的一种重要性状，植物株高性状既受内部基因控制，还受各种激素和外部环境因素的影响。植物矮化是矮秆主基因表达作用的结果，同时也受修饰基因和抑制基因的影响。通过矮化育种，降低植株高度，不仅使作物耐肥抗倒，而且改变了株型，可提高收获指数。申请号为CN201811376541.9的专利公开了一种通过构建含有西瓜GlaGA20ox基因序列的RNA干扰载体，通过花粉管通道法创制矮化西瓜新品种，该专利公开的方法只能在室外大田中进行试验操作，育种方法受时间和空间限制较大，且该方法培育的矮化西瓜有待于进一步优化。《菊花RNAi载体构建与青蒿遗传再生体系的建立》-遗传学专业论文，河南大学，2015，公开了以DNA甲基化修饰能影响植物的形态特征以及RNAi信号能够通过砧木传递，构建能够影响菊花但不影响青蒿MET1基因的RNAi载体，同时建立青蒿的遗传再生体系的方法，该方法利用的技术体系仅适用于无性繁殖体系，所利用的是干扰DNA甲基转移酶基因，仅仅能改变植株形态。西瓜具有遗传背景狭窄的特点，利用传统得方法培育兼具短蔓、花期推迟并且西瓜品质优的品种非常困难，目前尚未有技术公开可以通过转基因技术成功得到具有短蔓、花期推迟并且西瓜品质优的种子资源。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：为解决现有技术中存在的培育短蔓西瓜方法受时间和场地、目前尚无方法能够通过转基因技术成功得到具有短蔓、花期推迟的西瓜种质等问题，从而提供一种利用转基因技术培育短蔓花期延迟西瓜新种质的方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：首先，本专利技术提供了一种含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的RNAi载体的构建方法。其次，本专利技术还提供了一种利用转基因技术培育短蔓花期延迟西瓜新种质的方法。首先，本专利技术提供了一种含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的RNAi载体的构建方法，包括：将含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的正向序列和反向序列分别插入限制性内切酶HindIII、XbaI和KpnI、XhoI；然后将添加酶切位点的正向序列和反向序列插入用限制性内切酶HindIII、XbaI和KpnI、XhoI酶切的DHpart27RNAiFADp1P4载体中，得到所述含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的RNAi载体，其中，所述含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的序列如SEQIDNo.1所示。进一步的，本专利技术提供了一种含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的RNAi载体的构建方法，包括以下步骤：(1)设计含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段，其基因序列如SEQIDNo.1所示；具体的，先提取西瓜RNA，然后以提取的RNA为模板进行cDNA第一链的合成，然后再合成cDNA，再从西瓜基因序列Cla97C04G079450的ORF起始密码下游75-100碱基位置开始，寻找“AA”二连序列后的19个碱基序列，分析获得的序列，优选其中GC含量比值为45-55％之间的序列，然后在GeneBank中经BLAST全基因组扫描及序列同源性分析，以确保所选靶序列与其他基因序列没有同源性，得到含有西瓜基因序列Cla97C04G079450的干扰基因片段，作为cDNA，所述cDNA具有如下SEQIDNo.1所示的序列：AATATCTAAGGAAATATGGAATTCATCTTTTGGCGCTATCGCACGTTTACCTTGTTCCACATTTGAAGCAGCGATGCACCAAGCACTTGGCTCGAAATTTGACCATCGATAGCGTTATCGACATACTCCAACTCGCAAGAATGTGCGATGCACCAGATCTCTCACTCAGCTGTATGAAAATGGTGTCCAGCCACTTCAAGGCCGTCGAGAAAACGGAGGGCTGGAAATTCCTGCAAAAACACGACC；(2)克隆基因干扰片段SEQIDNo.1，以西瓜cDNA为模板，利用PCR方法在其正向序列的5’端和3’端引入限制性内切酶HindIII和XbaI，回收目的基因片段，得到RNAi-d1；优选地，设计分别带有HindIII和XbaI酶切位点的上下游扩增的SEQIDNo.1所示序列的基因干扰片段，所用引物序列如下：H1-F：5’-AAGCTTAATATCTAAGGAAAT-3’；H2-R：5’-TCTAGAGGTCGTGTTTTTGCAG-3’；(3)利用限制性内切酶HindIII和XbaI对DHpart27RNAiFADp1P4载体进行酶切，回收载体片段；(4)将步骤(2)添加酶切位点的干扰RNA序列RNAi-d1与步骤(3)得到的酶切的载体DHpart27RNAiFADp1P4进行连接，得到重组载体DHpart27RNAiFADp1P4；(5)克隆基因干扰片段SEQIDNo.1，以西瓜cDNA为模板，利用PCR方法在其反向序列的5’端和3’端引入限制性内切酶KpnI和XhoI，回收目的基因片段，得到RNAi-d2；优选地，在干扰RNA反向序列的5’端和3’端设计分别带有KpnI和XhoI酶切位点的上下游扩增的SEQIDNo.1所示序列的基因干扰片段，所用引物序列如下：d2-F:5’-GGTACCAATATCTAAGGAAATATG-3’d2-R:5’-CTCGAGGGTCGTGTTTTTGCAGG-3’。(6)利用限制性内切酶KpnI和XhoI对步骤(4)得到的重组载体DHpart27RNAiFADp1P4进行酶切，回收载体片段，作为重组载体1；(7)将步骤(5)得到的反向干扰RNA序列RNAi-d2与步骤(6)得到的重组载体1连接，得到重组载体2；(8)将步骤(7)构建的重组载体2转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆。进一步的，上述方法中，步骤(3)利用HindIII和XbaI对DHpart27RNAiFADp1P4载体进行酶切，反应条件为37℃，反应3h，回收载体片段。进一步的，上述方法中，优选步骤(4)所述将步骤(2)添加酶切位点的干扰RNA序列RNAi-d1与步骤(3)得到的酶切的载体DH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的RNAi载体的构建方法，其特征在于，包括：/n将含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的正向序列和反向序列分别插入限制性内切酶HindIII、XbaI和KpnI、XhoI；/n然后将添加酶切位点的正向序列和反向序列插入用限制性内切酶HindIII、XbaI和KpnI、XhoI酶切的DHpart27RNAiFADp1P4载体中，得到所述含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的RNAi载体，/n其中，所述含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的序列如SEQ ID No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的RNAi载体的构建方法，其特征在于，包括：
将含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的正向序列和反向序列分别插入限制性内切酶HindIII、XbaI和KpnI、XhoI；
然后将添加酶切位点的正向序列和反向序列插入用限制性内切酶HindIII、XbaI和KpnI、XhoI酶切的DHpart27RNAiFADp1P4载体中，得到所述含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的RNAi载体，
其中，所述含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的序列如SEQIDNo.1所示。


2.一种含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的RNAi载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段SEQIDNo.1；
(2)克隆基因干扰片段SEQIDNo.1，以西瓜cDNA为模板，利用PCR方法在其正向序列的5’端和3’端引入限制性内切酶HindIII和XbaI，回收目的基因片段，得到RNAi-d1；
(3)利用限制性内切酶HindIII和XbaI对DHpart27RNAiFADp1P4载体进行酶切，回收载体片段；
(4)将步骤(2)添加酶切位点的干扰RNA序列RNAi-d1与步骤(3)得到的酶切的载体DHpart27RNAiFADp1P4进行连接，得到重组载体DHpart27RNAiFADp1P4；
(5)以西瓜cDNA为模板，利用PCR方法在其反向序列的5’端和3’端引入限制性内切酶KpnI和XhoI，回收目的基因片段，得到RNAi-d2；
(6)利用限制性内切酶KpnI和XhoI对步骤(4)得到的重组载体DHpart27RNAiFADp1P4进行酶切，回收载体片段，作为重组载体1；
(7)将步骤(5)得到的反向干扰RNA序列RNAi-d2与步骤(6)得到的重组载体1连接，得到重组载体2；
(8)将步骤(7)构建的重组载体2转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆。


3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(2)所用引物序列为：
H1-F：5’-AAGCTTAATATCTAAGGAAAT-3’；
H2-R：5’-TCTAGAGGTCGTGTTTTTGCAG-3’。


4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(5...

【专利技术属性】
技术研发人员：董薇，吴德峰，黄甜，张海燕，朱莉莉，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：河南;41