呼吸道合胞病毒检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了保藏号ＣＧＭＣＣ　　１５４６的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株产生的抗呼吸道合胞病毒Ｎ蛋白单克隆抗体，及含有该单克隆抗体的呼吸道合胞病毒检测试剂盒（胶体金法）。该检测试剂盒可以快速检测呼吸道合胞病毒，特异性、敏感性及准确率高，保存和运输方便，临床及家居使用上极为便利，而且具有产业性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤细 胞株及含有该单克隆抗体的呼吸道合胞病毒检测试剂盒。
技术介绍
呼吸道合胞病毒(RSV，简称合胞病毒，属副粘病毒科)于1956年首次在 伴有感冒症状的猩猩体内分离到。是引起小儿病毒性肺炎最常见的病原，因其 在细胞培养中能形成特殊的细胞融和病变，故名。该病毒的感染可引起间质性 肺炎，及毛细支气管炎。在北京，48%的病毒性肺炎和58%的毛细支气管炎系由 合胞病毒引起U980 1984);在广州，小儿肺炎及毛细支气管炎的31.4%由合 胞病毒引起(1973 1986);在美国，20% 25%的婴幼儿肺炎和50% 75%的 毛细支气管炎由合胞病毒引起。RSV在电镜下所见与副流感病毒类似，病毒颗粒大小约为150nm，较副流 感病毒稍小，为RNA病毒，对乙醚敏感，无血球凝集性，在人上皮组织培养 形成特有的合胞(syncytium),病毒在胞浆内增殖，可见胞浆内包涵体。用分子 生物学方法证明合胞病毒有二个亚型。合胞病毒感染的潜伏期为2 8天(多为4 6天)。合胞病毒肺炎的典型所 见是单核细胞的间质浸润。主要表现为肺泡间隔增宽和以单核细胞为主的间质 渗出，其中包括淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞。此外肺泡腔充满水肿液，并可 见肺透明膜形成。在一些病例，亦可见细支气管壁的淋巴细胞浸润。在肺实质 出现伴有坏死区的水肿，导致肺泡填塞、实变和萎陷。由于母传抗体不能完全地预防感染的发生，合胞病毒肺炎在出生后任何时 候都可能发生。多见于3岁以下，1 6个月可见较重病例，男多于女。我国北 方多见于冬春季，广东则多见于春夏。由于抗体不能完全防止感染，合胞病毒 的再感染极为常见，有人观察10年，再感染发生率高达65%。合胞病毒的传染 性很强，有报道家庭成员相继发生感染，在家庭内发生时，年长儿及成人一般 为上呼吸道感染。文献报道院内继发合胞病毒感染率高达30% 50%。合胞病毒感染多见于婴幼儿，其中半数以上为1岁以内婴儿，男多于女， 其比例约为1.5 2 : 1。潜伏期约4 5日。初期可见咳嗽、鼻堵塞。约2/3的病 例有高热，最高可至4rc，但发热一般不是持续性的，较易由解热药退烧，高 热时间多数为1 4天，少数为5 8天。约l/3病儿中度发热，多持续1 4天。多数病例的热程为4 10天3轻症病例呼吸困难及神经症状不著，中、重症有 较明显的呼吸困难、喘憋、口唇青紫、鼻扇及三凹征，少数重症病例也可并发 心力衰竭。胸部听诊多有细小或粗、中罗音，叩诊一般无浊音，少数有过清音。临床病人由于不同的呼吸道病毒(如流感病毒、副流感病毒、腺病毒等) 感染引起的疾病症状可以十分相似。这导致了流行诊断比较困难，确诊往往依 赖于实验室诊断。快速诊断的方法应该是在疾病的发病初期就可以得到明确的 诊断，便于阻止疾病的传染及改变流行的爆发。目前呼吸道合胞病毒感染的检测主要有以下几种方法-一、 常规实验室检测-病毒分离法 实验室诊断呼吸道合胞病毒感染的金标准是病毒分离的方法。采用标本的时间以发病前5天为宜，取病人鼻咽棉拭子或咯痰进行病毒分离培养。该病毒 不能在鸡胚内增殖，只能在人和猴细胞如Hep-2，Hda等细胞株中培养增殖，约 培养2 3周才出现细胞界线不清、融合成多核巨细胞等的细胞病变，病毒通过 出芽释放。但是病毒分离的方法具有严重的缺陷。因为它们既费时又费力，通 常需要较长时间才能得到最终结果，这样在临床方面对病人的有效治疗有一定 的局限性。二、 快速诊断直接检査病毒蛋白抗原和病毒核酸可达到快速诊断的目的，常用的方法有 免疫荧光法、免疫酶法、放射免疫法、免疫胶体金法、电镜技术、核酸杂交和 PCR法等。 1、免疫学方法1、 l免疫酶法免疫酶法(EIA)的基本原理是利用酵与抗体与抗原结合后，形 成酶结合物，它既不改变抗体或抗原的免疫学活性，有保留酶本身的酶活性， 然后加入酶的相应低物，在酶的催化作用下使原来无色的低物发生水解、氧化 或其他反应，生成有色产物。EIA法敏感性高，特异性强，操作简便，肉眼可观察，便于大规模检测， 在呼吸道合胞病毒研究中，它主要用于合胞病毒的快速诊断和单克隆抗体的筛 选，较少用于病毒株的抗原性分析。1、 2免疫荧光法将患者的鼻咽分泌物脱落细胞涂片，用免疫荧光法可直接査合 胞病毒抗原。免疫荧光是一种高度敏感和特异的技术，但它需要在标本中少量 的细胞和专业的技术人员来解释结果。1、 3免疫胶体金胶体金标记，实际上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表 面的包被过程。吸附机理可能是胶体金表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。目前医学检验中应用的免疫胶体金诊断技术主要有 两种，胶体金快速免疫层析法和快速斑点免疫金渗滤法。这两种方法的基本原 理都是以微孔滤膜作为载体，包被已知抗原或抗体，加入待检标本后，经滤膜 的毛细吸管作用或渗滤作用使标本中的抗原或抗体与膜上的包被的抗体或抗原 结合，在用胶体金结合物标记而达到检测的目的。免疫胶体金快速诊断技术具有放射免疫法、酶免疫法等诊断方法不可取代 的优点首先，它不需要酶联免疫法中所需要的低物，因此可省去一些操作步 骤，使操作简单化；其次，胶体金无污染，不会危害操作者和污染环境；再次， 胶体金抗体复合物在冻干状态下室温储存稳定；此外胶体金还具有检测迅速、 灵敏、不需要复杂仪器设备、产物显色永久不褪等优点。由于免疫胶体金快速诊断技术己经日趋成熟，以及它的便捷、灵敏、安全、 低成本等优点，使其在诊断领域中迅速推广。目前市场上出售和文献报道主要 集中在妇女妊娠系列、病原体抗原或抗体检测系列、药物滥用检测系列、疾病 相关蛋白检测系列等。 2、基因诊断 2、 l核酸杂交法此法比电镜、免疫酶标等方法更为特异、敏感，而且可定量。目前常用于 呼吸道合胞病毒的快速诊断。核酸分子杂交技术能广泛的用于临床标本中病毒 序列的检测，只是因为常规的方法(如免疫学方法)就可以成功的检测临床标 本中的病毒，临床就不需要它来诊断疾病。另一方面，核酸分子杂交技术作为 诊断疾病的工具仍有一定的困难，如需要一定的设备，费时。故在许多实验室 尚不能作为常规诊断方法来应用，因此目前该方法仅用于研究。 2、 2RT-PCR对许多RNA病毒来说RT-PCR诊断方法比传统的病毒分离和抗原诊断方法 既快又灵敏。而且RT-PCR可以很容易的同时诊断多种病毒，另一些诊断方法如 病毒分离和免疫荧光分析却不能。尽管基因检测技术有很多优点，但也有不足之处，如PCR技术，最大的优 点恰恰带来了它在实际应用中的最大障碍，DNA扩增的高校性导致了极微量的 污染既可出现假阳性，因而使结果失真。此外病毒作为外原基因的入侵者，必 须在阐明其全部或部分核苷酸序列时，才可以设计引物或探针，进行核酸分子 杂交和PCR检测。从现有的呼吸道合胞病毒的检测方法可见，病毒分离、EIA、 RT-PCR诊断方法尽管都有一定的特异性和敏感性的优点，但在操作上需要专业技术人员、专门的仪器设备和特定的条件及费时等缺点，而近年发展成熟的免疫胶体金诊 断技术具有特异性高、敏感度高、操作简单而且不需要专业人员和仪器设备， 已经成为合胞病毒诊断新的发展方向。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可以快速、准确检验人呼吸道合胞病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有保藏号为ＣＧＭＣＣ１５４６的杂交瘤细胞株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王炳彦，
申请(专利权)人：北京阿斯可来生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]