本发明专利技术涉及一种用于诊断低危型人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）感染的荧光ＰＣＲ（聚合酶链式反应）检测方法，属于体外核酸诊断领域。本发明专利技术包括一个以荧光ＰＣＲ技术为基础的多重聚合酶链式反应（ＰＣＲ）体系，包含针对多种ＨＰＶ型的正、反向引物和荧光探针，在适合的ＰＣＲ条件下可在一个反应管中同时检测最多包括ＨＰＶ６、１１、４０、４２、４３、４４等６种ＨＰＶ型的ＤＮＡ。本发明专利技术可以简便快速地在临床样品中诊断ＨＰＶ感染，特异性高，对尖锐湿疣早期防治、阻断传染源、减少ＨＰＶ感染均有很大的临床价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于体外核酸诊断领域，是一种在临床样品中同时检测一种或多种人乳头状病毒(HPV)感 染荧光聚合酶链式反应(PCR)方法。背荣技术尖锐湿疣(Condyloma acuminata; Condyloma acuminatum: Genital warts)是人体感染人乳头痫病 毒(HPV)而引起的一种表皮癯样增生。病毒在被感染的皮肤和粘膜组织的基底层上复制，并诱导上皮增 殖，破坏细胞的生长调控，引起局部增生性病变。乳头癯病毒属于乳多空病毒科的乳头瘤病毒属，它包括多种动物的乳头瘤病毒和人乳头癯病毒 (Human Papillomavirus, HPV)。其中人乳头瘤病毒(HPV)是一种专性感染人表皮和粘膜鳞状上皮的 常见DNA病毒，可通过直接或间接接触污染物品或性途径传播，弓l起人类皮肤和粘膜的多种良性乳头状 瘤或疣，某些型别的感染还具致癌性。根据其致癌危险度，将HPV分为低危型和高危型，低危型主要导 致尖锐湿疣，包括HPV6/11/40/42/43/44等型别(G M C/ZflbW, a/, mv/d^te cf纽池uton of /wman pap祝omaWrus (ypes m cyto/ogiba//y norma/ women /n tfie /ntemafibna/ Agency for Researc/7 on Cancer WP/ p柳atence surveys a poo/ed朋s/ys扭，Lancef 2005; 3敝柳~卵)；高危型则包括 HPV16/18/31/33/35/58等(MV Jacobs, a/， A诉nera/ p/Zmer GP5VGP^-med紐ted PCR~enzy/ne /rrvnunoassay ;ne仿od for rapW defectfon of ，4 / Zg/wfsk and 6 /OM^/fsk /iu/na/i pap//tomaWn/s genotypes m cerWca/ scrapZngs J. C/Zn. MbroWo/., Mar 35:79f ~795.),其持续感染可最终导致宫 颈癌。近年来尖锐湿疣病例日趋增多，在欧美国家居性传播疾病的首位(SframM,/ y/amterE,柳amterE, ef a/, HPV infection /n ma/e partners of women vW协squamous加的ep欣e/Za/ neop/as/a and/or /)&/Misfc WPV Acte De加Wwweo/,付站'75:3"~3f 6)，据我国性病监測点报告，生殖器HPV检出率为30.69/10 万(寐银类煞FQ-PC/ 检浙在HPW、"麥头、鋭淑资梦斯护游座^。护厲麻风座炎剪染志2004' 20 7抑"90),仅次于淋病列我国性传播疾病的第二位(FregaA efa/， G紐irfcondy/o/naacwnZ朋ftim or busc/r/ce Lows/isteZn fu/nor: /eWew of tfie Wteraft/re and /eporf of抬/ee cases treated by C02 /aser swge/y A tong>te/m /b//OMM/p. i4nf/咖cer/ es. 2002, 22: f 20W204)。目前对于尖锐湿疣的诊断，主要依靠不洁性交史、外阴赘生物形态以及醋酸白试验(A l/W/csfro/n, efa/, 77w acefic acM tesf /n 6va'ualion of subcMWca' gen制pap柳omav/咖加/i9c(ton.. s compa/a&Ve s加dy on penoscopy'他topa协otogy' Wra/ogy and scami/ngr e/ecfron mft;mscopy疗nd/叩s, S狄.7/ansm. //if' Apr 68: 90~09.)，缺乏快速准确并早期诊断的方法。而该病潜伏期较长(平均3个月)、亚临床感染常 见、皮损形态多样，极易导致漏检。荧光PCR技术灵敏度高，特异性好，可实时监测反应进程，反应时 间可控制在两个半小时以内，而且是闭管操作，无需后处理过程，可最大限度避免反应产物污染，可望取 代传统方法进行HPV DNA的早期诊断。但目前市场上检測HPV低危型的荧光PCR诊断产品仅能检测两 种型别(HPV6/11,常见型别多达6种〉，临床上极可能漏检。荧光PCR技术(Ruoresence PCR) 1的5年由美国PE公司率先研制成功rtlf. J. E邻y a/, / ea/-77/neJan. 2006, Vb/. Ato. T ，65~256A它兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监測PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检測，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险。荧光PCR技术的荧光探针现已发展形成多种类型，如TaqMan探针Krause ef a/, ComparaftVe, Co//aJbo/a(/Ve, and On-S扭Va她ton of a 7^gMan PCR Mstf oe/ as 8 Too/ for Ce/tffisd PrDofucfor of F鹏/ , Ca/npytobacter-FABe C嫩朋s. /Vv>//sdancf &iv/ADn/nen&/Aficnubio/ogry' A收.2006, /o/. 72' A/o.8, .5463-5468. J ' Molecular Beacon探针6Anete J. af a/, Mo/ecu/ar-Beacon Mu他]p/ex Rea/-77fne PC/ Assay for DetecMon of柳rib cAio/e舰^pptod and Enw/romnenfa/ Mic/Dbtotogy' Sepf. 2006, Vo/. 72,他.9, 6424~6428.>) , FRET探针等，本方法涉及的是TaqMan探针技术，TaqMan探针是一条两端标记荧光基团的特异性寡核苷酸单链，5'端标记荧光报告基团，3'端标记荧光淬灭基团。其工作原理是1)聚合 引物和探针与靶序列特异性结合，Taq酶沿模板自5'端向3'端开始合成，此时探针保持完整，荧光报告基 团的荧光被荧光淬灭基团淬灭，不产生荧光信号。2)剪切当Taq酶沿模板合成至遇到探针时，将探针 5'端报告荧光基团剪切，游离下来的荧光报告基团会发出荧光。3)合成完成荧光的强度随PCR循环次 数增加而增强，且与PCR产物的数量呈正比。荧光检测仪器透过PCR管H/管壁能直接检測到荧光信号 的波长和浓度变化，因此荧光PCR检測技术能实现闭管实时监測PCR全过程的变化，PCR产物无需后 续检测和处理。TaqMan探针根据其3'端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种普通的TaqMan探针和TaqMan MGB探 针。MGB探针的淬灭基团为非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种诊断人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）感染的荧光ＰＣＲ方法，包括以下部分： （１）与多达６种ＨＰＶ ＤＮＡ互补的寡核苷酸序列用于ＰＣＲ扩增临床样品中获得ＤＮＡ的引物；在这里，每一个型别的引物序列包含： （ａ）一个能与一种ＨＰＶ型基因对应的靶序列上游第一个位点杂交的正向引物； （ｂ）一个能与一种ＨＰＶ型基因对应的靶序列下游的第二个位点杂交的反向引物； （ｃ）正向引物和反向引物不限于本说明书序列表列明的序列。 （２）用于检测ＨＰＶ的荧光标记一个或多个寡核苷酸序列探针，该探针能与位于靶序列中上述第一和第二个位点杂交之间的ＨＰＶ序列杂交。探针序列可以是ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１－６的序列或其互补序列，还可包括由所列序列或其互补序列衍生出来的、差别不大于８个碱基的寡核苷酸序列。 （３）对取得的样品进行ＰＣＲ扩增，其特征在于包括一对或多对引物及探针，以ＨＰＶＤＮＡ作为模板，一个反应体系中扩增一个或多个ＨＰＶ ＤＮＡ目标靶序列片段。通过检测ＰＣＲ反应体系中一个或多个不同荧光信号的变化，确定样品中是否感染ＨＰＶ，以及ＨＰＶ的含量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨梦甦，黄鹤，黄明辉，柏干荣，
申请(专利权)人：港龙生物技术深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]
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