一种检测DNA,RNA和超微量蛋白质的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测ＤＮＡ，ＲＮＡ和超微量蛋白质的方法，首先利用磁珠捕获探针上的捕获探针１（可为核酸或抗体）与纳米结合探针上捕获探针２（可为核酸或抗体）在液相中夹心ＥＬＩＳＡ检测靶分子，再利用磁铁吸附磁珠，很容易去除未结合的探针和其他杂质。由于纳米结合探针结合成千上万的生物素标记的条码ＤＮＡ，可把检测靶分子成千上万倍放大；每分子条码ＤＮＡ利用链亲和素－生物素系统可结合３分子含Ｔ↓［７］ＲＮＡ启动子的ＤＮＡ序列，从而可用ＴＭＡ技术定量检测条码ＤＮＡ，而条码ＤＮＡ与靶分子含量成正比。对特定的含Ｔ↓［７］ＲＮＡ启动子的ＤＮＡ序列，ＴＭＡ技术可在３小时内按一分子ＤＮＡ模板转录出约１万分子ＲＮＡ，相应地把条码ＤＮＡ扩增一万倍。

【技术实现步骤摘要】
,rna和超微量蛋白质的方法
本专利技术涉及采用DNA条码一纳米金一T7RNA转录扩增(Bio-DNA TMA) 方法检测DNA， RNA和超微量蛋白质的技术。
技术介绍
临床分子水平定量检测DNA， RNA和蛋白质已广泛应用于疾病诊断，疾病 疗效和预后的判断。目前一般釆用荧光定量PCR和RT-PCR， IVRNA转录介导 的杂交保护发光(TMA—HPA)检测DNA和RNA含量，发光ELISA检测微量 蛋白质。另外，还有一类不需靶分子扩增的核酸检测方法如分支DNA杂交技术 (bDNA)，捕获杂交技术(Hybrid Capture, HC)。近年以纳米材料发展的检测 DNA， RNA，微量蛋白质技术引人注目，如MirkinCA等专利技术的DNA条码一纳 米金技术(Bio-coded nanoparticles technology)检测DNA， RNA和超微量蛋白 质。各种技术都有其优缺点，核酸扩增技术灵敏度高，但易产生假阳性和假阴性， 并且实验条件要求高；杂交技术简便易自动化，重复好，但灵敏度较低，试剂成 本昂贵；纳米技术灵敏高，方便，成本较低，但定量需特需仪器，不易标准化和 大规模检测。
技术实现思路
为了吸取各方法的优点，避免其缺陷，本专利技术提供一种既具有PCR法的高 敏感性，又要避免PCR的缺陷，且简便易行的DNA条码一纳米金一T7RNA转 录扩增(Bio-DNATMA)方法检测DNA， RNA和超微量蛋白质，用于科研和 临床分子诊断。DNA条码一纳米金一T7RNA转录扩增(Bio-DNATMA)方法主要综合利用 纳米技术和TMA扩增技术的优点，克服各自的缺陷，建立的一种新的分子水平 检测DNA， RNA和超微量蛋白质技术。此技术首先利用磁珠捕获探针上的捕获 探针l(可为核酸或抗体)与纳米结合探针上捕获探针2(可为核酸或抗体)在液相中夹心ELISA检测耙分子，再利用磁铁吸附磁珠，很容易去除未结合的探 针和其他杂质。由于纳米结合探针结合成千上万的生物素标记的条码DNA，可 把检测靶分子成千上万倍放大；每分子条码DNA利用链亲和素一生物素系统可 结合3分子含T7RNA启动子的DNA序列，从而可用TMA技术定量检测条码 DNA，而条码DNA与靶分子含量成正比。对特定的含T7RNA启动子的DNA序 列，TMA技术可在3小时内按一分子DNA模板转录出约1万分子RNA，相应 地把条码DNA扩增一万倍。转录的RNA用高灵敏度的荧光染料RiboGreen荧 光光度法检测(可检测0.2ng的RNA)，通过上述三步放大反应，可把耙分子扩 增约3X1()S倍，可与PCR相媲美。Bio-DNATMA吸收了纳米金技术和TMA技术的扩增优点，灵敏度可达PCR 技术水平，理论上可检测一个耙分子。由于Bio-DNATMA不是直接扩增耙分子， 因而避免了PCR技术的假阳性问题，且操作简单，重复性好，易于大规模检测， 也不需要贵重仪器，成本相对较低。此技术可应用于检测DNA， RNA和超微量 蛋白质，特别是现在还没有成熟的分子水平检测体液中超微量蛋白质技术，因而 Bio-DNATMA具有广泛的应用价值。附图说明图1为磁珠捕获探针和纳米结合探针的制备示意图；图2为磁珠捕获探针和纳米结合探针夹心ELISA检测靶DNA的过程示意图；图3为生物素一链亲和素桥连TMA的过程示意4为TMA扩增反应示意图；图5为RiboGreen荧光定量检测RNA的示意图；图6为Bio-DNATMA检测RNA原理示意图；图7为Bio-DNATMA检测超微量蛋白质的原理示意图。具体实施方式原理1.磁珠捕获探针的制备表面带有游离-NH3的磁珠，与末端带有-SH的捕获探4针l (3末端带有-SH，中间带有PEG和10个连续的A，作为间隔桥梁序列， 5末端为与检测靶DNA 3末端互补的18—25bp碱基序列)用戊二醛的方法 连接氨基和巯基，使捕获探针1标记到磁珠表面，制成磁珠捕获探针(图1)。2. 纳米结合探针的制备纳米金颗粒的金原子与5末端带有-SH的捕获探针2 和条码DNA (条码DNA/捕获探针2为100: 1)在水溶液中形成共价键，牢 固结合在纳米金的表面，逐步加NaCl到终浓度为0.3M，使捕获探针2和条 码DNA在纳米金表面伸展(捕获探针2其5末端带有-SH，中间带有PEG 和IO个连续的A，作为间隔桥梁序列，3末端为与检测耙DNA5末端互补的 18—25bp碱基序列；条码DNA其5末端带有-SH，中间带有10个连续的A， 作为间隔桥梁序列，3末端为 一段与检测DNA不互补且无关的18-25bp DNA， 并用生物素标记)，制备纳米结合探针(图l)。3. 生物素标记的含TV启动子的DNA序列的制备设计引物F: 5-BI0TIN-GAG AGA GGA TCC AAG TAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3f5末端用生物素 标记，下划线部分为1V启动子序列)；R: 5-ATC TTG CAA GAA AAC AGA TGG CAAGCATGA CTC GAG GCG CCT TGT CCC AAG陽3 (下戈機部分为 T7 RNA酶终止序列).以pcDNA-HCCR质粒(HCCR基因cDNA克隆入 pET-30a表达质粒)为模板，PCR扩增HCCR基因的500bp序列，扩增产物 纯化后作为生物素标记的含IV启动子的DNA序列。4. Bio-DNATMA法检测靶DNA原理磁珠捕获探针上的捕获探针1与检测靶 DNA3末端互补，纳米结合探针捕获探针2与检测DNA5末端互补，在杂交 缓冲液中夹心法结合靶DNA，磁铁吸附磁珠捕获探针，去上清液，并洗涤， 去除未结合的纳米结合探针和其他杂质(图2)。再加入杂交缓冲液重悬磁珠， 以及链亲和素，生物素标记的含T7启动子的DNA序列，37°C，温育30分钟， 磁铁吸附磁珠捕获探针，去上清液，并洗涤，去除未结合的链亲和素，生物 素标记的含T7启动子的DNA序列(图3)。加入T7RNA聚合酶缓冲液，T7RNA 聚合酶和四种核苷酸(UTP， ATP， GTP,CTP)， 37°C，温育3小时，转录RNA(图4)， RNA的量与检测耙DNA含量成正比。转录的RNA用RiboGreen 荧光染料荧光光度计定量检测(图5)。5. Bio-DNATMA法检测DNA的扩增原理第一次扩增直径200nm的纳米结合探针可结合约10000条DNA条码，可 把靶DNA放大104倍。第二次扩增;每一条条码DNA可通过链亲和素结合3条 生物素标记的含T7启动子的DNA序列，放大3倍。第三次扩增每一条含T7 启动子的DNA序列在T7RNA聚合酶作用下，3小时可合成约10"个RNA分子， 此步放大104倍。RiboGreen荧光染料最低能够检测0.2ngRNA，约对应于108个 500bp的RNA分子。 一分子检测靶DNA通过三次放大反应可放大到3 X 108倍， 恰够RiboGreen荧光染料检测最低极限，因而理论上Bio-DNA TMA法可检测到 一分子耙DNA。6. Bio-DNA TMA法检测RNA原理磁珠捕获探针上的捕获探针1与检测靶 RNA3末端互补，纳米结合探针上捕获探针2与检测靶RNA5末端互补，在 杂交缓冲液中夹心法结合靶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测ＤＮＡ，ＲＮＡ或超微量蛋白质的方法，按照以下步骤进行：　　　　（１）制备磁珠捕获探针１以及结合有生物素标记的条码ＤＮＡ的纳米结合探针２；　　　　（２）利用磁珠捕获探针上的捕获探针１，以及纳米结合探针上捕获探针２在液相中夹心ＥＬＩＳＡ检测靶分子；　　　　（３）利用磁铁吸附磁珠，洗涤去除杂质；　　　　（４）加入链亲和素以及生物素标记的含ＲＮＡ启动子的ＤＮＡ序列，使条码ＤＮＡ与生物素标记的含ＲＮＡ启动子的ＤＮＡ序列结合；　　　　（５）利用磁铁吸附磁珠，洗涤去除杂质；　　　　（６）对含ＲＮＡ启动子的ＤＮＡ序列进行转录后检测转录的ＲＮＡ产物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘万里，曾木圣，宋立兵，
申请(专利权)人：广州市搏克生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]