本发明专利技术公开了一种筛选调节蓬乱蛋白与β－连环蛋白之间相互作用的调节剂的方法。本发明专利技术还公开了一种可抑制蓬乱蛋白与β－连环蛋白相互作用的物质，即Ｄｖｌ １－Ｃ多肽。本发明专利技术首次揭示在Ｗｎｔ信号转导途径中，蓬乱蛋白可与β－连环蛋白发生相互作用，从而影响Ｗｎｔ下游的信号转导。由于Ｗｎｔ途径下游的信号转导的异常激活与肿瘤的发生发展密切相关，因此本发明专利技术为筛选抑制肿瘤发生发展的药物提供了新靶点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及经典Wnt信号转导途径中的相互作 用蛋白及其用途。
技术介绍
经典Wnt信号转导途径调节控制了许多生命过程，这些过程包括生物体的 生长、发育、疾病、衰老与死亡等等；也包括细胞形态与功能的分化与维持、 免疫、应激、细胞癌变与细胞凋亡等等。Wnt信号转导途径在不同物种之间具 有高度的保守性，通过对果蝇、爪蟾、小鼠等模式生物的研究，已经大体确立 了经典Wnt信号转导途径的分子框架。发育过程中，特定的时间和特定的环境 诱导下，某些组织或细胞群体分泌Wnt蛋白，结合受体巻曲蛋白(Frizzled)家 族成员，和共受体低密度脂蛋白LRP5/6,将信号传递至细胞内。在没有Wnt信 号刺激时，这条信号转导途径的关键分子(3-连环蛋白(P-catenin)参与由Axin， 结肠癌抑制因子(APC)，糖原合酶激酶3(5(GSK3f3)，酪蛋白激酶1 (CK1)，以及 (3-TrCP蛋白形成的巨大的蛋白质复合物，在GSK3(3和CK1作用下受到磷酸化标 记，进而在(3-TrCP蛋白介导的泛素化修饰后被蛋白酶体降解。在Wnt信号刺激 下，胞内的Dishevelled (Dvl)和Frat等Wnt途径的正向调节分子打散Axin、 APC和GSK3等形成的降解复合物，Axin被LRP带上膜进而降解。(3-连环蛋白 磷酸化水平降低，进而可以在细胞质中大量积累。部分p-连环蛋白进入细胞核， 与核内的含有HMG-Box的转录因子-淋巴细胞增强因子1/ T细胞转录因子 (LEF1/TCF)家族的蛋白(如TCF-4)相互作用，启动下游耙基因的开放(Gurabiner BM. 1998. van Noort M. & Clevers H. 2002. Wodarz A. & Nusse R. 1998.)。Wnt信号转导途径不仅影响胚胎发育中的体轴诱导、胚层建立、体节分化、 组织或器官形成等一系列重要的早期事件，参与体细胞的分化和极化；而且在 成体中Wnt信号途径的异常活化已经证明与多种肿瘤的发生密切相关。研究发 现，大约90%的结肠癌都是由于Wnt信号转导途径的激活性突变而引起的，此外Wnt信号途径的异常活化还与一系列的肿瘤发生有关，比如小肠腺瘤、肝癌、 胃癌、食道腺癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌(Giles RH， van Es JH， Clevers H. 2003)中均发现了 Wnt信号异常或者是转导途径中信号分子的突变。因此对Wnt 信号转导途径的分子机制的研究和理解，对于探索肿瘤治疗药物、寻找新的药 物耙点和理论依据具有重要意义。经典Wnt信号转导途径的生物学功能主要是通过下游靶基因的表达而得以 实现。而很多靶基因比如c-myc、 cyclinDl，在细胞增殖中起到重要作用。研 究表明，在很多癌症细胞里可以检测到P-连环蛋白在细胞核中的大量积累以 及c-myc、 cyclinDl的高表达，说明这些肿瘤细胞中Wnt信号转导途径下游的 转录复合物处于高转录活性状态。因为转录复合物的活性高低直接关系到Wnt 信号效应，那么对转录复合物的分子调控机制的硏究，也就具有十分重要的意 义。综上，尽管目前本领域对于经典Wnt信号途径的分子机制有所了解，然而 对于该途径的异常活化的启动等环节仍然不清楚。因此，本领域需要进一步对 Wnt信号途径中一些关键影响因素加以研究，以期找到可调节Wnt信号转导途 径的物质，从而调控Wnt信号转导相关的细胞事件。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种筛选调节蓬乱蛋白与e-连环蛋白相互作用的调 节剂的方法。本专利技术的另一目的在于提供一种蓬乱蛋白的活性片段，其可用于制备调节 (特别是抑制)蓬乱蛋白和P -连环蛋白相互作用的调节剂(特别是抑制剂)，或用于 筛选调节蓬乱蛋白和P -连环蛋白相互作用的调节剂。在本专利技术的第一方面，提供一种筛选调节蓬乱蛋白(Dishevelled, Dvl)与 3-连环蛋白(P-catenin， P -cat)相互作用的调节剂的方法，所述方法包括以 下步骤(a) 将候选物质与蓬乱蛋白和e-连环蛋白相互作用的体系接触；和(b) 检测候选物质对蓬乱蛋白和e -连环蛋白之间相互作用的影响；其中，若所述候选物质可抑制或促进蓬乱蛋白和P-连环蛋白之间的相互作 用，则表明该候选物质是调节蓬乱蛋白和P-连环蛋白相互作用的调节剂。在本专利技术的另一优选例中，所述的相互作用是蓬乱蛋白和P-连环蛋白发生^口 口 o在本专利技术的另一优选例中，所述的蓬乱蛋白选自蓬乱蛋白1 (Dvl 1)、 蓬乱蛋白2 (Dvl 2)或蓬乱蛋白3 (Dvl 3)。在本专利技术的另一优选例中，步骤(a)包括向蓬乱蛋白和P-连环蛋白相 互作用的体系中添加候选物质；和步骤(b)包括检测蓬乱蛋白和P-连环蛋白相互作用情况，并与对照组比较， 其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、蓬乱蛋白和P -连环蛋白相互作用的 体系；若测试组中蓬乱蛋白和e-连环蛋白相互作用在统计学上低于(优选显著低 于，如低20%;更优选的低40%)对照组，就表明该候选物质是抑制蓬乱蛋白和 P-连环蛋白相互作用的调节剂；若测试组中蓬乱蛋白和P-连环蛋白相互作用在统计学上高于(优选显著低 于，如高20%;更优选的高40%)对照组，就表明该候选物质是促进蓬乱蛋白和 e -连环蛋白相互作用的调节剂。在本专利技术的另一优选例中，所述体系选自溶液体系、细胞体系、或组织体系。在本专利技术的另一优选例中，所述体系中还包含Wnt蛋白。 在本专利技术的另一优选例中，所述的Wnt蛋白包括但不限于Wntl蛋白、Wnt3a 蛋白或Wnt8蛋白。在本专利技术的另一优选例中，所述方法还包括对于筛选出的调节剂，进一步 测试其对于Wnt信号途径下游基因的影响；如果其可上调Wnt信号途径下游基 因的表达，则表明该调节剂是促进蓬乱蛋白和e-连环蛋白之间的相互作用的促 进剂；如果其可下调Wnt信号途径下游基因的表达，则表明该调节剂是抑制蓬乱蛋白和e-连环蛋白之间的相互作用的抑制剂。在本专利技术的另一优选例中，Wnt信号途径下游基因例如(但不限于)哺乳 细胞中的c-myc基因、cyclinDl基因、Axin2基因、LEF1基因、PPARdelta基 因；或鱼类(如斑马鱼)细胞中的^;f基因、";^基因。在本专利技术的另一优选例中，所述的Wnt信号途径下游基因异常活化(如上调)导致肿瘤(如结肠癌)的发生。在本专利技术的第二方面，提供一种通过所述的方法获得的调节蓬乱蛋白与P -连 环蛋白相互作用的调节剂。在本专利技术的另一优选例中，所述的调节剂是抑制剂，通过抑制蓬乱蛋白与e-连环蛋白的相互作用，从而抑制Wnt信号途径下游基因异常活化。在本专利技术的另一优选例中，所述的调节剂是抑制剂，所述的抑制剂为一种多肽，含有SEQ ID NO: 5中496 695位氨基酸序列。在本专利技术的另一优选例中，该多肽还含有核定位信号蛋白(NLS)的氨基酸序列。在本专利技术的另一优选例中，所述的核定位信号蛋白的氨基酸序列位于所述多 肽的C末端。在本专利技术的另一优选例中，所述的调节剂是一种核酸分子或其转录本 (mRNA)，所述核酸分子含有SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列。在本专利技术的第三方面，提供一种蓬乱蛋白的用途，用于筛选调节本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种筛选调节蓬乱蛋白与β－连环蛋白相互作用的调节剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： （ａ）将候选物质与蓬乱蛋白和β－连环蛋白相互作用的体系接触；和 （ｂ）检测候选物质对蓬乱蛋白和β－连环蛋白之间相互作用的影响； 其中，若所述候选物质可抑制或促进蓬乱蛋白和β－连环蛋白之间的相互作用，则表明该候选物质是调节蓬乱蛋白和β－连环蛋白相互作用的调节剂。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李林，甘肖箐，王计勇，席莹，王伟，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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