一种合成mcl-PHA的四种微生物混合发酵方法技术

本发明专利技术涉及一种合成mcl‑PHA的四种微生物混合发酵方法。四种微生物为重组菌P.putida‑acs KT2440；A.niger为中国微生物普通菌种保藏中心编号3.3928；酿酒酵母为S.cerevisiae L2612；醋酸杆菌经测序鉴定为A.orientalis。以淀粉为初始底物，先被A.niger水解为含葡萄糖的水解液，然后在S.cerevisiae L2612与A.orientalis混合发酵作用下生成含乙酸发酵液，最后P.putida‑acsKT2440以乙酸为底物合成终产物mcl‑PHA。通过人工构建混菌体系，将生物反应变成简单模块化工作，减少物质多级流动及能量消耗。

【技术实现步骤摘要】
一种合成mcl-PHA的四种微生物混合发酵方法
本专利技术提供一种合成mcl-PHA的微生物发酵方法。特别是涉及一种合成mcl-PHA的四种微生物混合发酵方法。
技术介绍
在几种正在开发的可生物降解的聚合物中，PHA由于其性能和与常规石油化学衍生塑料的相似性而受到了广泛关注[1]。目前正在研究不同的PHA在药物，缝线的控制释放，缝线，在骨板，伤口敷料，医疗辅助设备和治疗设备中的潜在应用，根据其结构特征将其最初分为两组[2,3]，对于中链长度的PHA(mcl-PHA)，是具有6至14个碳原子的单体聚合物，高生产成本是生产PHA的主要缺点之一。因此，已经进行了许多努力来通过改善细菌，有效的发酵和回收过程来降低生产PHA的成本，中链长度的聚羟基链烷酸酯(mcl-PHA)是主要由革兰氏阴性细菌合成的聚酯。他们的大部分研究工作都集中在使用假单胞菌作为微生物细胞工厂。报道了油假单胞菌和其他荧光假单胞菌生物合成mcl-PHA。相关学者投入了大量精力来生产PHA。恶臭假单胞菌是优良的中链长度的PHA产生菌株，并且可以利用多种底物，例如脂肪酸。Chinwetkitvanich,S.等人研究温度和磷限制对活性污泥生物质生产和储存聚羟基链烷酸酯(PHA)的影响，经过10天发酵，测得混合液中的最大PHA浓度分别为1,491、1,294和1,260mg/L[4]。因此它无法与较低的成本的石化塑料竞争。通过开发更好的菌株，制定有效的PHA发酵和回收策略，科研人员也为降低PHA生产成本做出了许多努力，因此使用廉价碳源也是当前的热门话题。淀粉是一种多羟基聚合物化合物。中国的淀粉产量仅次于美国，其来源广泛。在整个淀粉生产中，玉米淀粉的比例可以达到90％，马铃薯淀粉的比例可以达到7％。近年来，许多研究人员已将淀粉废水用作碳源并将其与活性污泥混合以生产PHA[4,5]。活性污泥厌氧发酵是目前廉价的碳源生产PHA的常用方法，挥发性脂肪酸(VolatileFattyAcid，简称VFA)由乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等小分子挥发性有机酸组成，而厌氧发酵过程中产生的VFA含量比例高。由于VFA组成种类繁多，使得微生物利用其作为碳源时可合成不同碳链长度的PHA，因为VFA合成比例组分具有不稳定的特性，因此当微生物使用VFA时，它们无法产生单一的目标PHA类。WFHu[6]仅通过调节使用乙酸钠作为碳源的培养液中加入活性污泥，并通过气体流量来调节和控制氧化还原电位，发现使用乙酸钠被用作唯一的碳源时PHA积累为细胞干重为35％(w/w)，说明乙酸可被用作底物合成PHA，且溶氧量在由EAS合成PHBV共聚物中的3HV亚基中起着非常重要的作用，溶氧量的高低直接决定了发酵周期。传统活性污泥法合成PHA虽较普遍，但活性污泥发酵周期过长，少则几周，多则数月，在此发酵过程中，反应釜持续运转，消耗大量能源。目前也尚未有学者对活性污泥混合菌群进行分离培养，得到高效快速合成PHA的混合菌群。仅仅证明假单胞菌属为PHA合成优势菌属。而且传统活性污泥合成的PHA为短链PHA的混合物，不适用于合成mcl-PHA。菌群微生物数量越多，代谢过程越复杂，物质转换效率也会随之下降。通过人工构建混菌体系，将复杂的生物反应变成简单的模块化工作，减少物质多级流动，仅使用几种微生物构建发酵体系合成mcl-PHA有利于提升mcl-PHA的生产效率。References:[1].Huang,T.Y.,etal.,ProductionofpolyhydroxyalkanoatesfrominexpensiveextrudedricebranandstarchbyHaloferaxmediterranei.JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology,2006.33(8):p.701-706.[2].Chen,L.J.andM.Wang,ProductionandevaluationofbiodegradablecompositesbasedonPHB–PHVcopolymer.Biomaterials,2002.23(13):p.2631-2639.[3].Sudesh,K.,H.AbeandY.Doi,Synthesis,structureandpropertiesofpolyhydroxyalkanoates:Biologicalpolyesters.ProgressinPolymerScience,2000.25(10):p.1503-1555.[4].Chinwetkitvanich,S.,C.W.RandallandT.Panswad,EffectsofphosphoruslimitationandtemperatureonPHAproductioninactivatedsludge.WaterScience&Technology,2004.50(8):p.135-143.[5].Chua,A.S.M.,etal.,Productionofpolyhydroxyalkanoates(PHA)byactivatedsludgetreatingmunicipalwastewater:EffectofpH,sludgeretentiontime(SRT),andacetateconcentrationininfluent.WaterResearch,2003.37(15):p.3602-3611.[6].Hu,W.F.,etal.,Synthesisofpolyhydroxyalkanoate(PHA)fromexcessactivatedsludgeundervariousoxidation-reductionpotentials(ORP)byusingacetateandpropionateascarbonsources.AppliedBiochemistry&Biotechnology,2005.121-124(1):p.289-301.
技术实现思路
一种合成mcl-PHA的微生物发酵工艺，即通过联合四种微生物，以淀粉为初始底物水解生成葡萄糖，通过酸化作用生成乙酸，最后合成终产物mcl-PHA，首次实现了从淀粉到mcl-PHA的转化。本专利技术涉及的重组菌P.putida-acs是按照天津大学于2018-8-9申请的中国专利申请号为2018-20180900753.6，专利技术名称为“一种提高P.putidaKT2440乙酸同化能力的方法”公开的提高乙酸同化能力的基因工程菌的构建方法构建的。A.niger为中国微生物普通菌种保藏中心，编号为3.3928。酿酒酵母为天津大学元英进教授实验室惠赠为S.cerevisiaeL2612，醋酸杆菌经测序鉴定为A.orientalis。本专利技术的一种合成mcl-PHA的微生物发酵方法，包括步骤如下：1)：将所得到的保存在斜面培养基的A.niger菌种转接到新的试管斜面上，经过培养待长满孢子继续转接到其他试管斜面培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种合成mcl-PHA的四种微生物混合发酵方法，其特征是四种微生物为重组菌P.putida-acs KT2440；A.niger为中国微生物普通菌种保藏中心，编号为3.3928；酿酒酵母为S.cerevisiae L2612；醋酸杆菌经测序鉴定为A.orientalis。/n

【技术特征摘要】
1.一种合成mcl-PHA的四种微生物混合发酵方法，其特征是四种微生物为重组菌P.putida-acsKT2440；A.niger为中国微生物普通菌种保藏中心，编号为3.3928；酿酒酵母为S.cerevisiaeL2612；醋酸杆菌经测序鉴定为A.orientalis。


2.一种合成mcl-PHA的四种微生物混合发酵方法，其特征是包括步骤如下：
1)：将所得到的保存在斜面培养基的A.niger菌种转接到新的试管斜面上，经过培养待长满孢子继续转接到其他试管斜面培养基上以备使用，分别将S.cerevisiaeL2612、A.orientalis、P.putida-acsKT2440甘油菌接种至试管中，进行摇瓶培养制作种子液；
2)：将含有A.niger黑色菌丝体琼脂平板培养基切成琼脂小块，将其添加至淀粉原料培养基中，在摇床下进行培养，发酵生成葡萄糖水解液；
3)、使用糖化后的葡萄糖水解液作为底物，同时添加S.cerevisiaeL2612与A.orientalis混合种子液，混合发酵生成含乙酸发酵液；
4)、使用3)中获得的乙酸发酵液作为底物，加入P.putida-acsKT2440种子液，在P.putida-acsKT2440胞内有效地...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾晓强，李苏航，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12