一种手性羟基酸酯的生物制备方法技术

本发明专利技术公开了一种手性羟基酸酯的生物制备方法，包括以下步骤：（1）将脂肪酸经酮化酶球形烯单氧酶氧化后生成4‑氧代脂肪酸；（2）4‑氧代脂肪酸经短链脱氢酶PpYSDR‑M85Q/L136A不对称还原得到R‑羟基酸酯。本发明专利技术手性羟基酸酯的生物制备方法通过构建短链脱氢酶突变体，其较野生型对酮酸的活性、手性选择性大幅提高能提高该酶在催化酮酸制备手性内酯上的效率，以充分发掘其应用价值，同时酶法合成手性羟基酸酯具有工艺简单、环境友好、效益高等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种手性羟基酸酯的生物制备方法
本专利技术属于生物化工
，尤其涉及一种手性羟基酸酯的生物制备方法。
技术介绍
手性化合物的两种对映异构体往往具有不同的功效或其作用效果相差甚远，因此，单一对映体的合成越来越受关注。光学活性手性内脂被广泛应用于手性天然香料。传统化学合成具有难度大、污染大的特点。脂肪酸经酮化酶氧化可得到酮酸。酮酸的不对称还原是制备光学活性手性羟基酸的重要方法，理论上能将100％底物酮酸转化为单一对映体的手性羟基酸，具有很高的工业应用价值。与化学法不对称还原相比，生物法催化法在化学选择性、区域选择性和立体选择性方面更具优势，产物光学纯度高；此外，生物催化通常在温和条件下进行，避免了剧烈化学反应过程中化合物的异构化、差向异构化、消旋和重排等现象的发生。因此，生物催化法合成光学活性手性内脂已成为最受瞩目的医药及精细化学品的绿色合成技术之一。在具有催化不对称还原潜手性内脂活性的酶中，短链脱氢酶由于其催化底物谱广、热稳定性好以及有机溶剂耐受性强等特点而倍受关注。
技术实现思路
本专利技术目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供一种手性羟基酸酯的生物制备方法，两步酶法实现R-羟基酸酯的生物制备。为了实现上述的目的，本专利技术提供以下技术方案：一种手性羟基酸酯的生物制备方法，包括以下步骤：（1）将脂肪酸经酮化酶球形烯单氧酶氧化后生成4-氧代脂肪酸；（2）4-氧代脂肪酸经短链脱氢酶PpYSDR-M85Q/L136A不对称还原得到R-羟基酸酯。进一步的，所述短链脱氢酶PpYSDR-M85Q/L136A由野生型短链脱氢酶PpYSDR经突变改造制得。进一步的，所述野生型短链脱氢酶PpYSDR经突变改造制得短链脱氢酶PpYSDR-M85Q/L136A的步骤如下：（1）突变体的构建：以含有突变点的寡核苷酸片段为引物分别进行PCR扩增反应，扩增含有PpYSDR基因的pET-30a重组质粒得到单点突变体后，再以该突变体的重组质粒为模板，另一突变体为引物，构建两点组合突变体；（2）短链脱氢酶突变体的诱导表达：将步骤1中构建的工程菌接种至50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜，再以1%接种量（v/v）接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6左右，加入终浓度为0.1mMIPTG，26℃诱导培养6h后，4℃、8000rpm离心10min收集菌体，-80℃储存备用。进一步的，所述步骤1中构建突变体所使用的基因工程菌为大肠杆菌，优选为E.coliBL21(DE3)大肠杆菌。进一步的，所述步骤1中构建突变体所使用的基因工程菌菌体的质量用量以菌体湿重计为50-300g/L。本专利技术的优点是：常规短链脱氢酶在催化酮酸（如4-氧代十酸甲酯、4-氧代十一酸甲酯）活性较低，本专利技术手性羟基酸酯的生物制备方法通过构建短链脱氢酶突变体，其较野生型对酮酸的活性、手性选择性大幅提高能提高该酶在催化酮酸制备手性内酯上的效率，以充分发掘其应用价值，同时酶法合成手性羟基酸酯具有工艺简单、环境友好、效益高等特点。具体实施方式以下结合具体的实例对本专利技术的技术方案做进一步说明：实施例1一种手性羟基酸酯的生物制备方法，包括以下步骤：（1）将脂肪酸经酮化酶球形烯单氧酶氧化后生成4-氧代脂肪酸；（2）4-氧代脂肪酸经短链脱氢酶PpYSDR-M85Q/L136A不对称还原得到R-羟基酸酯。其中酮化酶球形烯单氧酶为EC1.14.15.9-spheroidenemonooxygenase，含亚铁血红素，参与环状菌素和2，2'-双氧-螺菌黄素的生物合成，来源于Rhodobactercapsulatus，Rhodobactersphaeroides，Rhodovulumsulfidophilum，Rubrivivaxgelatinosus。其中步骤2反应如下式所示：所述短链脱氢酶PpYSDR-M85Q/L136A由野生型短链脱氢酶PpYSDR经突变改造制得，具体包括以下过程：突变体的构建：以含有突变点的寡核苷酸片段为引物，具体引物序列如下：M85Q-F：GGCGTCCAAGGCCCCCTGCCGCAAGACCT（SEQIDNO.1，下划线处为突变位点）M85Q-R：AGGGGGCCTTGGACGCCCGCATTGACGAAT（SEQIDNO.2，下划线处为突变位点）L136A-F：TCGATCGCTGGCAGCGTAACCATCCCCGA（SEQIDNO.3，下划线处为突变位点）L136A-R：GCTGCCAGCGATCGAACTCATGAAGGCCAG（SEQIDNO.4，下划线处为突变位点）将上述引物分别进行PCR扩增反应。采用QuickChangeTM方法（Stratagene,LaJolla，CA）扩增含有PpYSDR基因的pET-30a重组质粒得到单点突变体后，再以该突变体的重组质粒为模板，另一突变体为引物，构建两点组合突变体。其中，野生型短链脱氢酶PpYSDR的基因序列如SEQIDNO.5所示。野生型短链脱氢酶PpYSDR的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。突变型短链脱氢酶PpYSDR-M85Q/L136A的基因序列如SEQIDNO.7所示。突变型短链脱氢酶PpYSDR-M85Q/L136A的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。其中，PCR程序：（1）在98℃下预变性1min；（2）98℃，10s；55℃，10s；72℃，7min进行温度循环，循环20次后冷却至4℃。PCR产物经清洗后，利用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶DpnⅠ进行消化以降解甲基化模板质粒。酶切反应体系及条件：17μL经清洗处理的PCR产物，2.0μL10×缓冲液，1.0μL限制性内切酶DpnⅠ，37℃保温1h。将上述经酶切处理的PCR产物转化至E.coliBL21（DE3）中，得到相应的重组大肠杆菌，涂布于含卡那霉素的固体平板上，37℃下培养过夜，随机挑取单菌落进行菌落PCR鉴定和测序验证，结果表明含有羰基还原酶突变体基因的重组表达载体成功转化至表达宿主E.coliBL21（DE3）中。短链脱氢酶突变体的诱导表达：将上述构建的工程菌接种至50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜，再以1%接种量（v/v）接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6左右，加入终浓度为0.1mMIPTG，26℃诱导培养6h后，4℃、8000rpm离心10min收集菌体，-80℃储存备用。短链脱氢酶突变体的发酵罐培养：将上述构建的工程菌接种至50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜，再以2%接种量（v/v）接种至含50μg/mL卡那霉素的培养基中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种手性羟基酸酯的生物制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n（1）将脂肪酸经酮化酶球形烯单氧酶氧化后生成4-氧代脂肪酸；/n（2）4-氧代脂肪酸经短链脱氢酶PpYSDR-M85Q/L136A不对称还原得到R-羟基酸酯。/n

【技术特征摘要】
1.一种手性羟基酸酯的生物制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将脂肪酸经酮化酶球形烯单氧酶氧化后生成4-氧代脂肪酸；
（2）4-氧代脂肪酸经短链脱氢酶PpYSDR-M85Q/L136A不对称还原得到R-羟基酸酯。


2.根据权利要求1所述的手性羟基酸酯的生物制备方法，其特征在于，所述短链脱氢酶PpYSDR-M85Q/L136A由野生型短链脱氢酶PpYSDR经突变改造制得。


3.根据权利要求2所述的手性羟基酸酯的生物制备方法，其特征在于，野生型短链脱氢酶PpYSDR经突变改造制得短链脱氢酶PpYSDR-M85Q/L136A的步骤如下：
（1）突变体的构建：以含有突变点的寡核苷酸片段为引物分别进行PCR扩增反应，扩增含有PpYSDR基因的pET-30a重组质粒得到单点突变体后，再以该突变体的重组质粒为模板，另一突变体为引物，构建两点组合突变体；
（2）短链脱氢酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：于洪巍，贾卫民，王之建，俞鑫焱，洪一鸣，程存照，
申请(专利权)人：黄山科宏生物香料股份有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34