一种利用乙酸或丁酸生产聚羟基脂肪酸酯的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用乙酸或丁酸生产聚羟基脂肪酸酯的方法。本发明专利技术中，具有聚羟基脂肪酸酯生产能力的海神单胞菌能够利用乙酸或丁酸为碳源，在无需灭菌的开放条件下，积累大量的聚羟基脂肪酸酯，聚酯所占细菌干重的比例最高可达69％，以丁酸为碳源的得率最高可达理论得率的40％。该方法以丁酸或乙酸这两种不常见的碳源生产聚羟基脂肪酸酯，发酵过程无需灭菌，能够降低聚羟基脂肪酸酯的发酵成本，具有较大的经济优势和良好的工业应用前景。

A method of producing polyhydroxy fatty acid ester by using acetic acid or butyric acid

【技术实现步骤摘要】
一种利用乙酸或丁酸生产聚羟基脂肪酸酯的方法
本专利技术属于生物化学领域，涉及一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法，更具体涉及一种利用乙酸或丁酸生产聚羟基脂肪酸酯的方法。
技术介绍
聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，简称PHA)是一种微生物在生长代谢不平衡条件下在细胞内合成的一种高分子聚合物，主要作为碳源和能源的储存物质，在营养匮乏时可以被微生物重新分解利用。PHA有着与石油来源的塑料材料类似的材料学性质，同时具有许多石油来源的塑料材料缺少的优良性能，例如生物可再生性、生物可降解性、生物相容性等等。多年以来，PHA的合成和利用引起了科学界和工业界的广泛关注。人们在降低PHA的生产成本、合成具有新的单体组成和结构的PHA材料、开发多种PHA的高附加值应用等方面开展了许多研究工作，取得了一系列重要的研究成果。目前，PHA的生产成本仍然居高不下，限制了其大规模工业化生产和应用。利用较为廉价的底物替代工业发酵中广泛应用的葡萄糖等碳源，有助于降低发酵原料对粮食作物的依赖，解决与人争粮、与粮争地的难题，具有重要的意义。包括乙酸和丁酸在内的挥发性脂肪酸，能够由微生物转化各种生物质废弃物制备，近年来被认为是一种具有良好应用前景的发酵原料。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用乙酸或丁酸生产聚羟基脂肪酸酯的方法。本专利技术要求保护海神单胞菌在制备聚羟基脂肪酸酯中的应用。具体的，所用底物为非糖原料或挥发性脂肪酸；更具体可为丁酸或乙酸。本专利技术还要求保护一种制备聚羟基脂肪酸酯的方法，该方法包括：以前述底物，发酵培养海神单胞菌，得到所述聚羟基脂肪酸酯。上述方法中，在发酵起始时刻所述底物在体系中的浓度为10-20g/L。具体的，在发酵起始时刻所述丁酸在体系中的浓度为10g/L。在发酵起始时刻所述乙酸在体系中的浓度为20g/L。在发酵初始时刻，含有所述海神单胞菌的体系的OD600值为0.05-0.25；具体为0.1；所述发酵初始时刻，即将所述种子液接种至发酵培养基后的初始时刻；所述发酵培养步骤中，发酵温度为37℃；溶氧为10-50％；具体为30％；搅拌速率为200-800rpm；发酵时间为36-60h；更具体为48h；pH值为7-9；具体为8；空气的通气量为1-5L/min；具体为3L/min。所述发酵为液态发酵；所述发酵培养为开放培养；所述开放培养具体为开口揺瓶或在封口膜包覆不灭菌的环境(如揺瓶)中或在培养基和发酵罐体不灭菌且通入无需过滤除菌的空气的发酵罐中培养；所述发酵中，发酵体系由种子液、培养基和所述底物组成；所述种子液提供的有效成分为所述海神单胞菌；所述种子液的培养为无菌操作培养；所述培养基为液态培养基；具体为可用于所述海神单胞菌培养的任意培养基；更具体可为如下比例组成的液体TYS培养基：蛋白胨5g，酵母粉1g，用人工海水定容至1L；其中，所述人工海水由如下各比例的组分组成：氯化钠27.5g，氯化钾0.7g，六水合氯化镁5.4g，七水合硫酸镁6.8g，氯化钙1.05g，碳酸氢钠0.2g，用去离子水定容至1L即得。所述种子液可按照如下方法制得：a、菌种活化取保存于-80℃冰箱的菌种甘油管，划线接种至TYS培养基平板，37℃培养12-24h；b、一级种子液从完成所述步骤a的平板上挑取接单菌落，接种于液体TYS培养基，37℃，200rpm振荡培养10-12h，得到一级种子液；c、二级种子液取所述一级种子液，按照1％的接种量，接种于液体TYS培养基，添加10g/L乙酸或10g/L丁酸为碳源，37℃，200rpm振荡培养10-12h，得到二级种子液。本专利技术中，所述聚羟基脂肪酸酯具体可为聚-3-羟基丁酸酯、3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚酯或3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚酯；所述3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚酯为由3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚而得的酯；所述3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚酯为由3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚而得的酯。本专利技术所述海神单胞菌Neptunomonasconcharum，分离自海洋环境，能够在NaCl浓度25-50g/L条件下良好生长。不同于普通海洋微生物较低的最适生长温度，N.concharumJCM17730能够在普通工业发酵的30-37℃条件下良好生长。不同于大肠杆菌、乳酸菌、谷氨酸棒状杆菌和酿酒酵母等常见的发酵工业菌种，N.concharumJCM17730对葡萄糖、果糖、蔗糖等糖类碳源利用程度微弱，但能利用乙酸、丙酸和丁酸等挥发性脂肪酸为碳源进行快速生长。本专利技术中，具有聚羟基脂肪酸酯生产能力的海神单胞菌能够利用乙酸或丁酸为碳源，在无需灭菌的开放条件下，积累大量的聚羟基脂肪酸酯，聚酯所占细菌干重的比例最高可达69％，以丁酸为碳源的得率最高可达理论得率的40％。该方法以乙酸或丁酸这两种不常见的碳源生产聚羟基脂肪酸酯，发酵过程无需灭菌，能够降低聚羟基脂肪酸酯的发酵成本，具有较大的经济优势和良好的工业应用前景。附图说明图1为以海神单胞菌利用丁酸生产聚羟基脂肪酸酯的发酵罐培养。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步阐述，但本专利技术并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。聚羟基脂肪酸酯标品购于Sigma-Aldrich，货号为403121，产品名称为聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸)，其中聚-3-羟基丁酸含量为88mol％。下述实施例所用海神单胞菌Neptunomonasconcharum，可由日本微生物菌种保藏中心(JapanCollectionofMicroorganisms)购买获得，代表菌株保存于日本微生物菌种保藏中心(JapanCollectionofMicroorganisms)，保存编号是JCM17730。实施例中制备种子液的方法如下：a、菌种活化取保存于-80℃冰箱的菌种甘油管，划线接种至TYS培养基平板，37℃培养12-24h；b、一级种子液从完成所述步骤a的平板上挑取接单菌落，接种于液体TYS培养基，37℃，200rpm振荡培养10-12h，得到一级种子液；c、二级种子液取所述一级种子液，按照1％的接种量，接种于液体TYS培养基，添加10g/L乙酸或10g/L丁酸为碳源，37℃，200rpm振荡培养10-12h，得到二级种子液。实施例中冷冻干燥的方法：以乙酸或者丁酸作为碳源进行发酵后，取30ml发酵液，8000rpm离心10min，弃上清液后用去离子水重悬菌体，进行洗涤，再次8000rpm离心10min，收集菌体，进行冷冻干燥(将装有洗涤后菌体沉淀的离心管置于-20℃冷冻1h，再放入冷本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.海神单胞菌在制备聚羟基脂肪酸酯中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.海神单胞菌在制备聚羟基脂肪酸酯中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述制备中，所用底物为丁酸。


3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述制备中，所用底物为非糖原料或挥发性脂肪酸或乙酸。


4.一种制备聚羟基脂肪酸酯的方法，包括：
以权利要求2或3任一所述底物，发酵培养海神单胞菌，得到所述聚羟基脂肪酸酯。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：在发酵起始时刻所述丁酸在体系中的浓度为10g/L。


6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：在发酵起始时刻所述底物在体系中的浓度为10-20g/L；
具体的，在发酵起始时刻所述乙酸在体系中的浓度为20g/L。


7.根据权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于：在发酵初始时刻，含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：李正军，普楠，史理陇，陶观宝，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11