一种酸土脂环酸芽胞杆菌的分子检测方法技术

本发明专利技术公开了一种酸土脂环酸芽胞杆菌的分子检测方法，在Bca DNA聚合酶和RNase H酶的作用下，在60～65℃的温度下，SPIA的扩增反应仅需要一条混合引物即可完成。本发明专利技术可以解决RCA方法对于环化DNA的依赖及LAMP中极易出现的假阳性现象。这使得SPIA对于RCA而言具有更高的检测效率，对于LAMP而言具有更好的稳定性。SPIA方法作为一种新的核酸等温扩增技术，将更加完善、更加突出等温扩增技术的优势。

【技术实现步骤摘要】
一种酸土脂环酸芽胞杆菌的分子检测方法
本专利技术涉及微生物检测
，特别涉及一种酸土脂环酸芽胞杆菌的分子检测方法。
技术介绍
核酸体外扩增技术是分子生物学研究的基础，也是生物学分析的重要方法，通过核酸扩增可以扩增和分离目的基因，使其在临床医疗诊断、基因突变监测、分子诊断、食品安全检测及环境安全监测等领域具有重要用途。随着分子生物学的发展与生物物理学在该领域的广泛应用,核酸扩增技术受到越来越多的关注。常见的核酸扩增技术有聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增(LAMP)以及滚环等温扩增(RCA)方法，这些方法都在微生物检测领域有广泛的应用，有成功的实践经验，是现今为止较为成熟的检测方法。但是每一种技术都有自身缺陷。PCR方法作为最原始的体外核酸扩增技术，发展时间最长，也最为稳定。该方法首先需要一对引物引发扩增反应，然后经过“变性—退火(复性)—延伸”三个步骤不断的重复实现产物积累。PCR反应的基本原理为：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90～95℃一定时间后，使DNA双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50～60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70～75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。由此可见，在PCR实施过程中需要不断进行变温循环，这使得PCR的实施需要依赖于温度循环仪。该仪器现今为止价格依然昂贵，对于一些中小型企业，或是基层的检测机构而言，无疑增加了负担，对该方法的推广也增加了难度。LAMP方法是由日本人Notomi在2000年专利技术的，其特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物(上游内引物FIP、下游内引物BIP、上游外引物F3及下游外引物B3)，在链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下，60-65℃恒温扩增，60分钟左右即可实现109～1010倍的核酸扩增，具有操作简单、灵敏度高等特点。在LAMP的操作过程中，假阳性问题十分凸显。根据报道，引起LAMP假阳性的主要有两个原因，一是由于多条引物之间的相互作用，二是由于受到气溶胶的影响。但这些问题在LAMP操作中难以真正得到解决。首先，引物之间的相互作用，由于LAMP本身需要4条引物，有时为了加快反应速率，可能会使用多达6条引物，所以引物之间的发生相互作用的几率也就更大。这也为LAMP的引物设计过程也增加的更大的难度。为找到合适的引物，需要对很多套引物分别进行试验，从中挑选适宜的引物，该过程费时费力且增加成本。另外，实验室的客观条件决定了LAMP操作过程中受到气溶胶影响的可能性，想要免除气溶胶的影响，实验室需要有良好的条件，且操作人员需要有较高的素质。这些都在一定程度上限制了LAMP的推广。RCA方法起始于1998年，该技术模拟自然界微生物环状DNA的滚环复制过程，同样在具有链置换活性的DNA聚合酶(BstDNApolymerase)作用下由一条引物即可引发沿环形DNA模板的链置换合成，实现环状DNA模板的体外等温扩增。针对于环状DNA，RCA方法展现了较好的优越性，但是对于更常见的线性DNA而言，RCA则需要首先进行一个独立步骤，获得环化的DNA。该过程依赖于锁式探针，获得含有一定长度的目的序列的环状DNA。包括探针设计以及使用探针生成环状DNA的过程，使得RCA反应需要消耗更长的时间，进行更复杂的步骤，花费更高的成本。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种酸土脂环酸芽胞杆菌的分子检测方法，可以解决RCA方法对于环化DNA的依赖及LAMP中极易出现的假阳性现象。这使得SPIA对于RCA而言具有更高的检测效率，对于LAMP而言具有更好的稳定性。SPIA方法作为一种新的核酸等温扩增技术，将更加完善、更加突出等温扩增技术的优势，可以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种酸土脂环酸芽胞杆菌的分子检测方法，在BcaDNA聚合酶和RNaseH酶的作用下，在60～65℃的温度下，SPIA的扩增反应仅需要一条混合引物即可完成，具体包括如下步骤：步骤1：反应开始时，混合引物和链终止多聚核苷酸(blocker)分别与单链模板DNA相应位置结合，然后在BcaDNA聚合酶的作用下从引物3'端开始靶序列互补链的合成；步骤2：当链延伸到blocker序列，链延伸终止；步骤3：在引物结合模板并开始延伸的同时，延伸产物5'端的RNA部分，与模板形成了DNA/RNA杂合双链，被RNaseH酶切割降解，暴露出引物的RNA部分结合位点；步骤4：RNA结合位点暴露后，新的自由引物会通过其RNA部分与模板上相应的位置结合；步骤5：直到blocker结合处，置换出一条完整的与靶序列互补的DNA单链；同时新引物与模板DNA形成的DNA/RNA杂合双链中的RNA部分再次被RNaseH酶切割降解，然后重复进行引物结合和链置换合成，进入循环过程；步骤6：最后反应扩增出大量的与靶序列互补的DNA单链产物。进一步地，SPIA反应引物为一条3'端是DNA片段5'端是RNA片段的组合引物。进一步地，SPIA反应在进行核酸扩增过程中需要4种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)包括：脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧核糖胸腺嘧啶三磷酸(dTTP)。进一步地，在SPIA反应中，缓冲液选用BcaDNA聚合酶和RNaseH酶产品套装中携带的2×BcaDNApolymerasebuffer和5×RNaseHbuffer反应缓冲液。进一步地，SPIA反应的第一个阶段为预变性过程，在200μL离心管中加入混合引物、blocker、dNTPs、MgSO4、BovineSerumAlbumin、RecombinantRNaseInhibitor、RecombinantRNaseInhibitor、5×RNaseHbuffer、2×BcaDNAbuffer、基因组DNA和RNase-freewater混合液通过95℃预变性80s，然后冷却至常温，迅速添加BcaDNA聚合酶和RNaseH酶，利用实时荧光监测仪，设置反应温度为60℃，时间120min，在试验过程中可以依据扩增的荧光信号强度随时终止反应。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术(单引物等温扩增技术检测酸土脂环酸芽胞杆菌(SPIA))作为一种新的核酸等温扩增技术，与目前常见的聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增(LAMP)以及滚环等温扩增(RCA)相比，具有以下优点：(1)单个引物：该种检测方法只需要一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酸土脂环酸芽胞杆菌的分子检测方法，其特征在于，在Bca DNA聚合酶和RNaseH酶的作用下，在60～65℃的温度下，SPIA的扩增反应仅需要一条混合引物即可完成，具体包括如下步骤：/n步骤1：反应开始时，混合引物和链终止多聚核苷酸(blocker)分别与单链模板DNA相应位置结合，然后在Bca DNA聚合酶的作用下从引物3'端开始靶序列互补链的合成；/n步骤2：当链延伸到blocker序列，链延伸终止；/n步骤3：在引物结合模板并开始延伸的同时，延伸产物5'端的RNA部分，与模板形成了DNA/RNA杂合双链，被RNase H酶切割降解，暴露出引物的RNA部分结合位点；/n步骤4：RNA结合位点暴露后，新的自由引物会通过其RNA部分与模板上相应的位置结合；/n步骤5：直到blocker结合处，置换出一条完整的与靶序列互补的DNA单链；同时新引物与模板DNA形成的DNA/RNA杂合双链中的RNA部分再次被RNase H酶切割降解，然后重复进行引物结合和链置换合成，进入循环过程；/n步骤6：最后反应扩增出大量的与靶序列互补的DNA单链产物。/n

【技术特征摘要】
1.一种酸土脂环酸芽胞杆菌的分子检测方法，其特征在于，在BcaDNA聚合酶和RNaseH酶的作用下，在60～65℃的温度下，SPIA的扩增反应仅需要一条混合引物即可完成，具体包括如下步骤：
步骤1：反应开始时，混合引物和链终止多聚核苷酸(blocker)分别与单链模板DNA相应位置结合，然后在BcaDNA聚合酶的作用下从引物3'端开始靶序列互补链的合成；
步骤2：当链延伸到blocker序列，链延伸终止；
步骤3：在引物结合模板并开始延伸的同时，延伸产物5'端的RNA部分，与模板形成了DNA/RNA杂合双链，被RNaseH酶切割降解，暴露出引物的RNA部分结合位点；
步骤4：RNA结合位点暴露后，新的自由引物会通过其RNA部分与模板上相应的位置结合；
步骤5：直到blocker结合处，置换出一条完整的与靶序列互补的DNA单链；同时新引物与模板DNA形成的DNA/RNA杂合双链中的RNA部分再次被RNaseH酶切割降解，然后重复进行引物结合和链置换合成，进入循环过程；
步骤6：最后反应扩增出大量的与靶序列互补的DNA单链产物。


2.如权利要求1所述的酸土脂环酸芽胞杆菌的分子检测方法，其特征在于，SPIA反应引物为一条3'端是DNA片段5'端是RNA片段的组合引物。


3.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：马晓燕，张伟，张蕴哲，张先舟，苑宁，杨粤，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北;13