【技术实现步骤摘要】
扩增DNA的方法本申请是申请日为2016年4月26日、申请号为201610264059.0、专利技术名称为“扩增DNA的方法”的中国专利申请的分案申请,原申请的所有内容通过引用并入本申请。
本专利技术涉及扩增DNA的方法,特别涉及扩增单细胞全基因组DNA并对其进行测序的方法。
技术介绍
单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增,获得高覆盖率的完整基因组后进行高通量测序。目前主要的全基因组扩增技术主要有四类:扩增前引物延伸聚合酶链式反(PrimerExtensionPreamplification-PolymeraseChainReaction,简称为PEP-PCR,具体方法参见ZhangL,CuiX,SchmittK,HubertR,NavidiW,ArnheimN.1992.Wholegenomeamplificationfromasinglecell:implicationsforgeneticanalysis.ProcNatlAcadSciUSA.89(13):5847-51.)、退变寡核苷酸引物聚合酶链式反应(DegenerateOligonucleotide–PrimedPolymeraseChainReaction,简称为DOP-PCR,具体方法参见TeleniusH,CarterNP,BebbCE,NordenskjoM,PonderBA,TunnacliffeA.1992.Degenerateolig ...
【技术保护点】
1.一种扩增基因组DNA的方法,所述方法包括:/n(a)提供第一反应混合物,其中所述第一反应混合物包括包含所述基因组DNA的样本、第一引物、核苷酸单体混合物和核酸聚合酶,其中所述第一引物从5’端到3’端包含通用序列和第一可变序列,所述第一可变序列包括第一随机序列,其中所述第一随机序列从5’端到3’端依次为X
【技术特征摘要】
1.一种扩增基因组DNA的方法,所述方法包括:
(a)提供第一反应混合物,其中所述第一反应混合物包括包含所述基因组DNA的样本、第一引物、核苷酸单体混合物和核酸聚合酶,其中所述第一引物从5’端到3’端包含通用序列和第一可变序列,所述第一可变序列包括第一随机序列,其中所述第一随机序列从5’端到3’端依次为Xa1Xa2……Xan,所述第一随机序列的Xai(i=1-n)均属于同一个集合,所述集合选自B、或D、或H、或V,其中B={T、G、C},D={A、T、G},H={T、A、C},V={A、C、G},其中Xai表示第一随机序列5’端的第i个核苷酸,n是选自3-20的正整数,
可选地,所述第一反应混合物进一步包括第三引物,其中所述第三引物从5’端到3’端包含所述通用序列和第三可变序列,所述第三可变序列包括第三随机序列,其中所述第三随机序列从5’端到3’端依次为Xb1Xb2……Xbn,所述第三随机序列的Xbi(i=1-n)均属于同一个集合,所述集合选自B、或D、或H、或V,其中B={T、G、C},D={A、T、G},H={T、A、C},V={A、C、G},并且Xbi(i=1-n)和Xai(i=1-n)属于不同的集合,其中Xbi表示第三随机序列5’端的第i个核苷酸,n是选自3-20的正整数;
(b)将所述第一反应混合物置于第一温度循环程序进行预扩增,获得预扩增产物;
(c)提供第二反应混合物,所述第二反应混合物包括步骤(b)中得到的预扩增产物、第二引物、核苷酸单体混合物和核酸聚合酶,其中所述第二引物从5’端到3’端包含或由特定序列及所述通用序列组成;
(d)将所述第二反应混合物置于第二温度循环程序进行扩增,获得扩增产物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中第一随机序列的Xai(i=1-n)均属于集合B,第三随机序列的Xbi(i=1-n)均属于集合D。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述第一可变序列和所述第三可变序列进一步在其3’端包括固定序列,所述固定序列能够提高基因组覆盖度的碱基组合。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述固定序列选自CCC、AAA、TGGG、GTTT、GGG、TTT、TNTNG或GTGG。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述第一可变序列选自Xa1Xa2……XanTGGG或Xa1Xa2……XanGTTT,所述第三可变序列选自Xb1Xb2……XbnTGGG或Xb1Xb2……XbnGTTT。
6.根据权利要求1所述的方法,其中选择所述通用序列以使得其基本上不会与基因组DNA结合产生扩增,所述通用序列长度为6-60bp,优选地,其中选择所述通用序列使得扩增产物能够直接进行测序,更优选地,其中所述通用序列选自SEQIDNO:1[TTGGTAGTGAGTG]、SEQIDNO:2[GAGGTGTGATGGA]、SEQIDNO:3[GTGATGGTTGAGGTA]、SEQIDNO:4[AGATGTGTATAAGAGACAG]、SEQIDNO:5[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAG]或SEQIDNO:6[GCTCTTCCGATCT]。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述通用序列和所述第一可变序列直接相连,或者所述通用序列和所述第一可变序列通过第一间隔序列相连,所述第一间隔序列为Ya1……Yam,其中Yaj(j=1-m)∈{A、T、G、C},其中Yaj表示间隔序列5’端的第j个核苷酸,m是选自1-3的正整数。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述通用序列和所述第三可变序列直接相连,或者所述通用序列和所述第三可变序列通过第三间隔序列相连,所述第三间隔序列为Yb1……Ybm,其中Ybj(j=1-m)∈{A、T、G、C},其中Ybj表示间隔序列5’端的第j个核苷酸,m是选自1-3的正整数。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其中所述m=1。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述第一引物包括GCTCTTCCGATCTYa1Xa1Xa2Xa3Xa4Xa5TGGG、GCTCTTCCGATCTYa1Xa1Xa2Xa3Xa4Xa5GTTT或其混合物,所述第三引物包括GCTCTTCCGATCTYb1Xb1Xb2Xb3Xb4Xb5TGGG、GCTCTTCCGATCTYb1Xb1Xb2Xb3Xb4Xb5GTTT或其混合物,其中Ya1∈{A、T、G、C},Yb1∈{A、T、G、C},所述Xai(i=1-5)∈{T、G、C},所述Xbi(i=1-5)∈{A、T、G}。
11.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法进一步包括对步骤(d)中获得的扩增产物进行测序的步骤,其中所述第二引物包括与测序用引物的部分或全部互补或者相同的序列,优选地,其中所述通用序列包括与测序用引物的部分或全部互补或者相同的序列。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述第二引物的特定序列包括与测序用引物的部分或全部互补或者相同的序列,优选地,其中所述第二引物的特定序列进一步包括与测序平台的捕捉序列部分或全部互补或者相同的序列,和/或其中所述第二引物的特定序列中包含的与测序用引物的部分或全部互补或相同的序列包含或由SEQIDNO:31[ACACTCTTTCCCTACACGAC]、或SEQIDNO:32[GTGACTGGAGTTCAGACGTGT]组成,和/或其中所述第二引物的特定序列中包含的与测序平台的捕捉序列部分或全部互补或相同的序列包含或由SEQIDNO:33[AATGATACGGCGACCACCGAGATCT]、或SEQIDNO:34[CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT]组成,和/或其中所述第二引物的特定序列进一步包括标识序列,所述标识序列位于所述与测序平台的捕捉序列部分或全部互补或相同的序列和所述与测序用引物的部分或全部互补或相同的序列之间。
13.根据权利要求1所述的方法,其中所述第二引物包括具有相同通用序列和不同特定序列的引物混合物,所述不同特定序列分别与同一测序中用到的测序引物对中不同引物的部分或全部互补或相同。
14.根据权利要求1所述的方法,其中所述第二引物包括SEQIDNO:35[AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT]和SEQIDNO:36[CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT]所示的序列的混合物。
15.根据权利要求1所述的方法,其中所述核酸聚合酶具有热稳定和/或链置换活性,可选地,其中所述核酸聚合酶选自:Phi29DNA聚合酶、BstDNA聚合酶、Pyrophage3137、Vent聚合酶、TOPOTaqDNA聚合酶、9°Nm聚合酶、KlenowFragmentDNA聚合酶I、MMLV反转录酶、AMV反转录酶、HIV反转录酶、T7phaseDNA聚合酶变种、超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、BstDNA聚合酶、E.coliDNA聚合酶、LongAmpTaqDNA聚合酶、OneTaqDNA聚合酶、DeepVentDNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶、DeepVent(exo-)DNA聚合酶,及其任意组合。
16.根据权利要求1所述的方法,其中步骤(b)使得所述第一类引物的可变序列能够与所述基因组DNA配对并扩增所述基因组DNA以得到基因组预扩增产物,其中所述基因组预扩增产物的5’端包含所述通用序列,3’端包含所述通用序列的互补序列。
17.根据权利要求1所述的方法,
其中所述第一温度循环程序包括:
(b1)能够打开所述DNA双链以获得DNA单链模板的温度程序;
(b2)能够使所述第一引物以及可选的第三引物与所述DNA单链模板结合的温度程序;
(b3)在所述核酸聚合酶的作用下能够使与所述DNA单链模板结合的第一类引物延伸长度以产生预扩增产物的温度程序;
(b4)重复步骤(b1)到(b3)至指定的第一循环次数,其中所述指定的第一循环次数大于1;
可选地,
i.其中在进行第一次循环时,步骤(b1)中所述DNA双链为基因组DNA双链,所述温度程序包括在90-95℃的温度之间变性反应1-20分钟;和/或
ii.其中在进行第一次循环后,步骤(b1)中所述的温度程序包括在90-95℃的温度之间解链反应3-50秒;和/或
iii.当进行到第二次循环后,所述预扩增产物包含在5’端包含所述通用序列,3’端包含所述通用序列的互补序列的基因组预扩增产物;和/或
iv.其中在步骤(b1)后并且在步骤(b2)之前不包括将所述第一反应混合物置于适当的温度程序使得所述基因组预扩增产物的3’端与5’端杂交结合以形成发卡结构的额外步骤;和/或
v.其中所述步骤(b2)包括将所述反应混合物置于多于一种的温度程序,以促使所述第一类引物充分与所述DNA模板有效结合,可选地,其中所述多于一种的温度程序包括:介于10-20℃之间的第一温度...
【专利技术属性】
技术研发人员:高芳芳,陆思嘉,任军,
申请(专利权)人:序康医疗科技苏州有限公司,
类型:发明
国别省市:江苏;32
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