水稻种子中白叶枯病菌LAMP快速检测方法及应用技术

本发明专利技术属于作物分子遗传育种学领域，公开了水稻种传白叶枯病菌的LAMP快速检测方法，包括如下步骤：(1)取水稻种子样品，提取水稻种子样品基因组DNA。(2)将水稻种子基因组DNA模板加入LAMP反应体系中进行环介导等温扩增。根据反应溶液颜色的变化判断样品中是否含有水稻白叶枯病菌。通过本发明专利技术提供的方法可以快速准确的诊断出水稻种子中是否含有水稻白叶枯病菌，有利于防治水稻白叶枯病害，减少经济损失。

【技术实现步骤摘要】
水稻种子中白叶枯病菌LAMP快速检测方法及应用
本专利技术属于农作物分子遗传育种学领域，涉及水稻种子中白叶枯病菌LAMP快速检测方法及应用。
技术介绍
水稻是我国最重要的粮食作物之一，对保障我国粮食安全和国民经济增长具有重要意义。白叶枯病是水稻生产上最重要的细菌性病害，白叶枯病菌经水流传播到秧田，引起秧苗发病。秧苗期淹水，秧苗被感染的机会增多，淹水没顶次数越多，时间越长，秧苗带菌率越高。而病谷产生的水稻种子也会携带白叶枯病菌，并随来年播种继续传播，因此，种植无病原菌的种子对于控制这种病害至关重要。LAMP技术(环介导等温扩增技术)是日本学者Notomi在2000年公开的一种新型的核酸扩增技术(NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH,etal.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA[J].NucleicAcidsResearch,2000,28(12):e63.)，这是一种能在恒温条件下，对DNA模板的六个区域设计四条引物，利用链置换性聚合酶扩增DNA的技术。因为其极高的特异性和灵敏度且反应在恒温下发生的特性，环介导等温扩增技术已被广泛运用于病原物检测领域。
技术实现思路
本专利技术的目的是：基于LAMP技术(环介导等温扩增技术)建立一种快速检测水稻种子中白叶枯病菌的方法，为农业生产上提供一种方便快捷、安全可靠的检测技术，的本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：一种LAMP引物组合物，由SEQIDNO.1所示的引物F3，SEQIDNO.2所示的引物B3，SEQIDNO.3所示的引物FIP，SEQIDNO.4所示的引物BIP，SEQIDNO.5所示的引物LF以及SEQIDNO.6所示的引物LB组成。本专利技术所述的LAMP引物组合物在检测水稻种子白叶枯病菌中的应用。一种检测水稻种子白叶枯病菌的LAMP快速检测试剂盒，包含本专利技术所述的LAMP引物组合物。LAMP技术(环介导等温扩增技术)检测水稻种传白叶枯病菌，包含如下操作步骤：(1)取水稻种子样品，提取水稻样品基因组DNA；(2)对水稻白叶枯病菌基因中一段168bp的序列(NCBI登录号：AF169031)进行LAMP引物,并且这段DNA序列从未被用于白叶枯病菌的检测，针对这段DNA序列设计了多组引物，经过大量的筛选工作，剔除了那些扩增效果不好、稳定性差的引物，最终留下了一组引物,如表1所示。(3)按照体系：10×isothermalamplificationbuffer2.5ul，5MBetainsolution4ul，2mMHNB(羟基萘酚蓝)溶液2μl，2uM表1中所述的LAMP引物FIP、BIP各2.0μl，10uM表1中所述的LAMP引物F3、B3各1.0μl，10μM表1中所述的LAMP引物LF、LB各0.5μl，10mMdNTPMix3.5.0μL，8U/μLBstDNAPolymerase1.0μL，水稻种子样品基因组模板DNA2.0μl，依次加入试管中，并加水至26μl混匀。(3)将上述体系放在在biometre扩增仪上进行扩增。反应温度为恒温65℃，时间为一小时。反应结束后观察试管中颜色的变化，如果反应液颜色由紫色变为蓝色，则检测到了水稻白叶枯病菌；如果反应液颜色没有发生变化，则种子中不带有水稻白叶枯病菌。表1LAMP引物序列名称引物序列(5’—3’)F3CATCGGATGCGCGCTATC(SEQIDNO.1)B3CCAAGTGGACGACAATGGTC(SEQIDNO.2)FIPGGTCGCTTGGACTCAGCATGAGCTCAAAGCATTTGGTCTGC(SEQIDNO.3)BIPACCTGCACATTGGCGACGTTAGCTGCCAATTTTCGAGCAC(SEQIDNO.4)LFGGATGAAGATTATCGATCGCAACT(SEQIDNO.5)LBCCGAAGAAAACACCTGGGG(SEQIDNO.6)有益效果本专利技术提供的利用LAMP技术(环介导等温扩增技术)快速检测水稻种子带白叶枯病菌的方法，具有以下优点：(1)反应在65℃恒温下进行，因此只需一台水浴锅即可，节省了检测成本。另外检测结果可视化，通过肉眼观察反应液颜色变化来判断检测结果，且反应时间只用1h，方便快捷。(2)检测灵敏度高。通过与传统PCR扩增检测相比，本专利技术的检测灵敏度提高了100倍。注意事项(1)用于LAMP检测的各种试剂极易被污染导致假阳性的发生，在操作的过程中一定要细心谨慎，避免污染试剂影响实验结果。(2)由于气溶胶污染的情况，实验场所要注意通风。反应过后的试管，枪头等要及时处理。附图说明：图1：水稻种子基因组DNA环介导等温扩增结果。其中：1，2号管为加水阴性对照,结果呈紫色；3-8号管为加入6组水稻种子基因组DNA模板，结果呈蓝色,说明3-8号管水稻种子中均含有白叶枯病菌。图2：LAMP引物的位置图3：普通PCR和LAMP的灵敏度比较其中：A.LAMP中1，2号管为加水阴性对照，,结果呈紫色；3-8号管分别为浓度100ng/ul，10ng/ul，1ng/ul，100pg/ul，10pg/ul，1pg/ul的水稻白叶枯病原菌DNA扩增结果；其中3-8号管呈蓝色。B.普通PCR中1-6号条带分别为100ng/ul，10ng/ul，1ng/ul，100pg/ul，10pg/ul，1pg/ul的水稻白叶枯病原菌DNA扩增结果。图4：LAMP特异性验证。其中：1号管为加水阴性对照，结果呈紫色；2号管为加白叶枯病菌DNA为阳性对照，结果呈蓝色；3-10管为加其它细菌的DNA,结果呈紫色。具体实施方式实施例1(一)材料与方法：1.水稻白叶枯病菌菌株；6组病谷产生的水稻种子。2.DNA提取方法：用CTAB法提取水稻白叶枯病菌小种PXO99和6组水稻种子的基因组DNA。3.LAMP反应体系：体积为26ul，其中20uMFIP和BIP引物2ul，10uMF3和B3引物0.5ul，10uMLF和LB引物1ul，10mMdNTPs3.5ul，8U/ulBstDNA聚合酶1ul，50mMMgSO44ul，10×isothermalamplificationbuffer2.5ul，5MBetainsolution4ul，2mMHNB2ul，模板DNA1ul，依次加入试管中，并加水至26μl混匀。反应条件为：密闭条件下，65℃恒温扩增1h。根据颜色变化判断反应结果，如果反应液由紫色变成蓝色，证明该样品中含有水稻白叶枯病菌，如果溶液颜色不变化，证明该样品中不含有水稻本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种LAMP引物组合物，其特征在于由SEQ ID NO.1所示的引物F3，SEQ ID NO.2所示的引物B3，SEQ ID NO.3所示的引物FIP，SEQ ID NO.4所示的引物BIP，SEQ ID NO.5所示的引物LF以及SEQ ID NO.6所示的引物LB组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种LAMP引物组合物，其特征在于由SEQIDNO.1所示的引物F3，SEQIDNO.2所示的引物B3，SEQIDNO.3所示的引物FIP，SEQIDNO.4所示的引物BIP，SEQIDNO.5所示的引物LF以及SEQIDNO.6所示的引物LB组成。


2.权利要求1所述的LAMP引物组合物在检测水稻种子白叶枯病菌中的应用。


3.一种检测水稻种子白叶枯病菌的LAMP快速检测试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的LAMP引物组合物。


4.一种水稻种子中白叶枯病菌的LAMP快速检测方法，其特征在于如下步骤：
(1)取水稻种子样品，提取水稻种子样品基因组DNA；
(2)利用权利要求1所述的LAMP引物组合物对所述的水稻种子样品基因组DNA进行环介导等温扩增，扩增结果直接通过反应液颜色...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍永美，张红生，尹航，王玮，黄骥，王建飞，程金平，陈孙禄，高秀莹，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32