适用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系制造技术

本发明专利技术属于海水养殖病害防控技术领域，具体涉及一种适用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系。通过设计特异性引物进行重组酶聚合酶扩增反应，对产物进行凝胶电泳验证后，根据是否有目的条带出现定性判断检测样品是否含有美人鱼发光杆菌美人鱼亚种。本发明专利技术提供了一种稳定、特异、高效的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种重组酶聚合酶扩增(RPA)反应体系，该反应体系对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种具有特异性，在此基础上开展美人鱼发光杆菌美人鱼亚种RPA检测技术研究，为实现美人鱼发光杆菌美人鱼亚种精准、快速的RPA检测奠定了技术基础。

【技术实现步骤摘要】
适用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系
本专利技术属于海水养殖病害防控
，具体涉及一种适用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系。
技术介绍
美人鱼发光杆菌(Photobacteriumdamselae)广泛分布于全球海洋环境中，是弧菌科(Vibrionaceae)发光杆菌属(Photobacterium)的一种重要致病菌，包括美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(P.damselaesubsp.damselae,PDD)和美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(P.damselaesubsp.piscicida,PDP)两个亚种，其中杀鱼亚种只感染鱼类，而美人鱼亚种不仅可以感染多种海洋动物，还可以感染人发病。美人鱼发光杆菌美人鱼亚种由美国科学家于1981年首次报道，随后世界各地陆续有该菌感染鱼类、甲壳类、软体动物、海龟、鲸鱼和海豚等不同海洋动物发病的案例。1982年，TheLancet杂志首次报道了美人鱼发光杆菌美人鱼亚种感染人发病的案例，在这之后日本、美国、香港、沙特阿拉伯等地的科学家多次报道了该菌感染人发病并致死的病例。现有的研究已经证实，美人鱼发光杆菌美人鱼亚种是一种来自海洋环境的、对人有致死能力的人鱼共患病原。该菌在海洋环境中广泛分布，不仅会对海水养殖生产造成经济损失，还会对海水养殖从业者、浴场旅游人员、海上作业人员等构成一些潜在的公共卫生风险，应引起足够的重视。在前期的研究过程中，我们已经发现美人鱼发光杆菌美人鱼亚种在我国的海水养殖环境中普遍存在，可以感染石斑鱼、鲆鲽类、许氏平鲉等多种鱼类，没有明显的地域或宿主特异性。为了更好的防控该菌的感染和传播扩散，研发其精准、快速的检测技术尤为重要，可以为临床的诊治提供重要的技术支撑。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是美人鱼发光杆菌美人鱼亚种在海洋环境中广泛分布，不仅会对海水养殖生产造成经济损失，还会对海水养殖从业者、浴场旅游人员、海上作业人员等构成一些潜在的公共卫生风险，必须防控该菌的感染和传播扩散。为解决上述问题，我们提供了一种稳定、特异、高效的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种重组酶聚合酶扩增(RPA)反应体系，该反应体系对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种具有特异性，在此基础上开展美人鱼发光杆菌美人鱼亚种RPA检测技术研究，为实现美人鱼发光杆菌美人鱼亚种精准、快速的RPA检测奠定了技术基础。为达到上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：适用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系，通过设计特异性引物进行重组酶聚合酶扩增反应，对产物进行凝胶电泳验证后，根据是否有目的条带出现定性判断检测样品是否含有美人鱼发光杆菌美人鱼亚种。进一步的，所述特异性引物是基于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的Mcp基因设计的，分别为DNA正向序列：PDDF:5’-CTGTCTCATGATGTGGCCCAAGTAAGTGAAG-3’和反向序列：PDDR：5’-GCGACTTTGCTCGATAGCCGCTACGGCATTG-3’，运用该特异性引物扩增的Mcp基因的目的片段长度为300bp。这对引物序列是我们测定美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的全基因组序列后，通过对基因组数据库的分析，筛选Mcp基因的部分序列作为目标片段(划线部分，其中斜体部分为本专利技术的引物)。美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的Mcp基因序列全长如下：ATGAATTTAAATCACTTAAGTATTAAGAAAAAACTGATCCTCGCCATGATCAGTGCGGTACTATTTTCTACTGCTCTTGTTGGTATTTTAAGCCAACAACAAGCACGAAAAGTCATTGAAACTCGCTTACTTGAATCGGAAATTCCTGCGACTTTGCTGCAGATTCGCAACCAAATCGATAAAGAAGTTTCCTTGTTGCAAGCAGCGGCACAACAACTGGCAACCAACCCATTAGTGATTGATTCACTCACCGCAACGCTGCCTCAAGATAACACCCAGCTCGTTACCTTACTTAACGAGATCAAGCAGCAATATCATCTATTTGATGCCTCTATTGCGGATCGAAATACAGGAAACTACTGGAACCAAGACGGTTTTTTACGCCAGCTTAACCACCAACAAGATAGCTGGTTCTACAACTTTGTCCGCAGTGGCAACGCTAAGATGCTCAATGTCTTTCGTGAAGCCAATGGTGATGTAAAACTGTTTGTTAATTACCAACAACTCAATGGTAAAGGGCTAGCTGGCTTGTCTAAATCGTTAGATGAAATGGTGCAATTTATTAATCAATTTAAACTTGAGCAAACTGGCTTTGTTTATCTGGTTGATGATAAAGGTATTGTGCGAATTCATAATGATAACCAGTTGATGGGAAAAGCAAGCTTAACCGATTTATACGGTAGCAAGGTGGCAAACCAACTGTTAAAACGAGGCAAAATCGAAATCGTGGATCTTGATCTTGCAGGCCAAGAAAATCTTGTTGCTTCAAGTTATATCCCAACGATGAATTGGTATGTCATCGCCCAATTACCTAAAAATGAAGCGTTTGCGAGCCTCAACCATGCCCGTAATCAAATTTTAATCTGGACTGCCATCATTGCGCTTGGCTTTACTGCGTTAGCGATTTGGCTTGCGAGCTCCATTACCCGTCCAATCGCTCGTTTAGCCGAAATGTTTAAAGATCTTGGTGAAGGTGAAGGCGATCTACGTCATCGTCTAGACATTCAAGGTAACGATGAAATTGCCCAACTGTCCCAAGGCTTTAATGGTTTTATTAGCAAAATCCATAATTCGGTAAAAGAAGTTGCGGAAACAGGAAATGCCCTACGTCACGCCTCTCAATCGGTAGCGGAACAAGCACAAACGACCTTAGATAACAGCCAAAGCCAACGCGATCGCACCATTCAAGTGGTAACCGCGATTAATGAGATGGGGGCAACCGTCAATGAAATTGCAGGTAATGCTGCTCAAGCCGCTGACGCCACTCACCTAGCAGAAACGGAAGCACAAAGTGGTCAACAGGTTGTTGGGCAAGCAAGAGAAACCATTTCACAACTGTCTCATGATGTGGCCCAAGTAAGTGAAGTGATTGAATCTTTGGCCCATAACACCCAAGCCATTGGCAGCATTTTGGATGTGATCCGTGGTATTTCAGAACAAACGAACTTATTGGCATTGAACGCAGCCATTGAAGCAGCTCGTGCTGGTGAGCAAGGTCGTGGTTTTGCCGTTGTTGCTGATGAAGTGCGCAGTCTTGCTAGTCGAACAGCGGCTTCAACTG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系，其特征在于：通过设计特异性引物进行重组酶聚合酶扩增反应，对产物进行凝胶电泳验证后，根据是否有目的条带出现定性判断检测样品是否含有美人鱼发光杆菌美人鱼亚种。/n

【技术特征摘要】
1.用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系，其特征在于：通过设计特异性引物进行重组酶聚合酶扩增反应，对产物进行凝胶电泳验证后，根据是否有目的条带出现定性判断检测样品是否含有美人鱼发光杆菌美人鱼亚种。


2.如权利要求1所述的用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系，其特征在于：DNA正向序列：PDDF:5’-CTGTCTCATGATGTGGCCCAAGTAAGTGAAG-3’和反向序列：PDDR：5’-GCGACTTTGCTCGATAGCCGCTACGGCATTG-3’。


3.如权利要求2所述的用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系，其特征在于：所述特异性引物基于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的Mcp基因设计，运用该特异性引物扩增的Mcp基因的目的片段长度为300bp。


4.如权利要求2所述的用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系，其特征在于：用于检测的RPA反应体系总体积为46.5μL，包含2×ReactionBuffer缓冲液25μL，10×BasicE-mix5μL，上述浓度为10μM的PDDF和PDDR引物各2.4μL，dNTP酶9.2μL，20×CoreReactionMix2.5μL。


5.一种权利要求1所述用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)在无菌的200μLP...

【专利技术属性】
技术研发人员：张正，于永翔，陈京，王印庚，廖梅杰，荣小军，张浩，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37