本发明专利技术公开了一种筛选Family B DNA Polymerase抗体封闭聚合酶活性的方法，包括如下步骤：合成引物S1‑F3和S1‑R2，两引物的3’端部分互补，将引物混合并退火；接着，加入足量dNTPs，在热启动酶的作用下延伸引物，随后通过荧光染料检测反应体系中产物的熔解曲线，由该检测结果确定抗体是否能够封闭聚合酶活性。本发明专利技术还公开了一种筛选Family B DNA Polymerase抗体封闭聚合酶活性的试剂盒。本发明专利技术的筛选Family B DNA Polymerase抗体封闭聚合酶活性的方法，其无放射性污染，灵敏度高，具有较好的工业应用价值。
【技术实现步骤摘要】
筛选FamilyBDNAPolymerase抗体封闭聚合酶活性的方法
本专利技术属于生物工程领域，具体地说，是关于一种筛选FamilyBDNAPolymerase抗体封闭聚合酶活性的方法。
技术介绍
FamilyBDNAPolymerase是新一代的高保真DNA聚合酶。该酶基于PyrococcusFuriosisDNAPolymerase，经基因工程改造而成。其蛋白结构包含5’→3’聚合酶结构域和经过改造的3’→5’外切酶结构域。这种组合大幅度提升了酶的耐热性，保真性。耐热温度达到98℃，保真性是TaqDNA聚合酶的52倍，普通PfuDNA聚合酶的6倍。酶溶液中添加了独特的延伸因子，扩增速度达到15sec/kb。本产品配备了优化后的酶缓冲液，添加了PCR增强组分，使得该酶具有极强的扩增效率和广泛的模板适应性，非常适合复杂模板的扩增。扩增产物为平末端，可磷酸化后克隆到平滑末端载体中。该酶可应用于高保真PCR、基因克隆、定点突变、高通量PCR。该FamilyBDNAPolymerase抗体与FamilyBDNAPolymerase具有很高的亲和力，高温50℃处理30min，依旧可以封闭其聚合酶活性，其热启动酶在预变性温度下加热30sec完全失活，释放出DNA聚合酶活性。使用该热启动酶可以有效抑制引物非特异性退火导致的扩增。但是，在筛选抗体之前，首先要解决的是如何建立筛选FamilyBDNAPolymerase抗体封闭聚合酶活性的方法。现有的方法，一般地，是通过测定DNAPolymerase的活性来间接确定其抗体的活性。而标准的DNAPolymerase活性测定方法采用放射性底物掺入法，即采用以3H标记的dTTP为底物，经DNAPolymerase将其掺入到活化的大马哈鱼精子DNA上。经过TCA沉淀、whatman滤纸过滤，通过测定酸不溶性产物中放射性同位素的量，计算出DNAPolymerase的活性。这种方法易产生放射性污染，且步骤多、周期长，难以实现高通量、自动化，因此为筛选带来了困难。
技术实现思路
本专利技术的的第一个目的是提供一种简便、灵敏、重现性好、非放射性的筛选FamilyBDNAPolymerase抗体封闭聚合酶活性的方法。本专利技术的第二个目的是提供一种筛选FamilyBDNAPolymerase抗体封闭聚合酶活性的试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：作为本专利技术的第一个方面，一种筛选FamilyBDNAPolymerase抗体封闭聚合酶活性的方法，包括如下步骤：步骤一、合成引物S1-F3和S1-R2，将引物混合并退火，其中，所述S1-F3和S1-R2的3’端部分互补；步骤二、加入足量dNTPs，在热启动酶的作用下延伸引物，在40℃下反应30min；所述热启动酶为FamilyBDNAPolymerase抗体和FamilyBDNAPolymerase的复合物；步骤三、取出，加入可以特异结合双链DNA并发荧光的物质，上机，观察熔解曲线，由该检测结果确定抗体是否能够封闭聚合酶活性。根据本专利技术，所述可以特异结合双链DNA并发荧光的物质为SYBRgreen、evagreen、EB等。根据本专利技术，所述S1-F3和S1-R2的引物序列分别如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；根据本专利技术，所述延伸引物的反应体系为：10xReactionBuffer，pH8.0，2μL；2.5mMdNTPs，3.2μL；引物S1-F3和S1-R2各1μL；热启动酶，10μL；DDW补足20μL。作为本专利技术的第二个方面，一种筛选FamilyBDNAPolymerase抗体封闭聚合酶活性的的试剂盒，包括如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的引物S1-F3和S1-R2。本专利技术的有益效果是：无放射性污染，而且该方法的操作步骤简单快速，无需TCA沉淀、洗涤、干燥、洗脱等；可实现高通量、自动化的检测、直观的检测热启动酶的封闭效果。附图说明图1为FamilyBDNAPolymerase抗体的筛选原理图。图2为熔解曲线设置程序。图3为FamilyBDNAPolymerase抗体+FamilyBDNAPolymerase(Yeasen：10148)的检测示例图。图4为商品热启动酶(KAPALibraryAmplificationKits：KK2610)的检测示例图。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。本专利技术通过研究，建立了筛选FamilyBDNAPolymerase抗体封闭聚合酶活性的方法，以用于筛选FamilyBDNAPolymerase抗体，筛选原理如图1所示。具体过程为：首先合成一对部分碱基互补的引物S1-F3和S1-R2，将引物混合并退火，接着，加入足量dNTPs，在热启动酶的作用下延伸引物，随后通过荧光染料检测反应体系中产物的熔解曲线，由该检测结果确定抗体是否能够封闭聚合酶活性。若抗体无聚合酶封闭活性，则在聚合酶的作用下延伸为双链DNA，得到产物的特征峰(Tm，DNA双链解链50％的温度)；若抗体有聚合酶封闭活性，则不能进行延伸，仅有引物二聚体的特征峰，根据这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开。以下为本专利技术的实验材料1、FamilyBDNAPolymerase：高保真DNA聚合酶(Yeasen：10148)；2、商品热启动酶：HiFiAmplificationMixKAPALibraryAmplificationKits(KAPA：KK2610)。实施例1反应体系的建立(1)引物S1-F3和S1-R2的设计引物S1-F3和S1-R2的3’端的部分碱基互补，两引物不完全互补，具体序列如下：S1-F3：5’-gagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgatagg-3’：(SEQIDNO：1)S1-R2：5’-gaacaggacaaaggaagagagtcagtgcctatcagaaacccaagagtctt-3’。(SEQIDNO：2)(2)延伸反应体系，反应体系如表1所示表1延伸反应体系组分加入量10xReactionBuffer(pH8.0)2μLdNTPs(2.5mM)3.2μLS1-F3(10uM)1μLS1-R2(10uM)1μL热启动酶10μLDDWTo20μL40℃30min。一种筛选FamilyBDNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种筛选Family B DNA Polymerase抗体封闭聚合酶活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤一、合成引物S1-F3和S1-R2，两引物的3’端部分互补，接着，将引物混合并退火；/n步骤二、加入足量dNTPs，在热启动酶的作用下延伸引物，在40℃下反应30min，所述热启动酶为Family B DNA Polymerase抗体和Family B DNA Polymerase的复合物；/n步骤三、取出，加入可以特异结合双链DNA并发荧光的物质，上机，观察熔解曲线，由该检测结果确定抗体是否能够封闭聚合酶活性。/n
【技术特征摘要】
1.一种筛选FamilyBDNAPolymerase抗体封闭聚合酶活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、合成引物S1-F3和S1-R2，两引物的3’端部分互补，接着，将引物混合并退火；
步骤二、加入足量dNTPs，在热启动酶的作用下延伸引物，在40℃下反应30min，所述热启动酶为FamilyBDNAPolymerase抗体和FamilyBDNAPolymerase的复合物；
步骤三、取出，加入可以特异结合双链DNA并发荧光的物质，上机，观察熔解曲线，由该检测结果确定抗体是否能够封闭聚合酶活性。
2.如权利要求1所述的筛选FamilyBDNAPolymerase抗体封闭聚合酶活性的方法，其特征在于，所述S1-F3和S1-R2的引物序列分别如SEQIDNO：1和SEQID...
【专利技术属性】
技术研发人员：周其好，孙永祥，严广号，李剑辉，宋东亮，
申请(专利权)人：武汉翌圣医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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