万古霉素衍生物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种全新的万古霉素衍生物及其制备方法和应用，特别是使用该万古霉素衍生物制备得到高免疫原性的万古霉素人工抗原，进而免疫实验动物得到高效价的抗万古霉素特异性抗体；本发明专利技术还提供了使用该万古霉素衍生物制备得到万古霉素酶标偶联物。含有上述抗万古霉素特异性抗体与万古霉素酶标偶联物的万古霉素与去甲万古霉素免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对万古霉素与去甲万古霉素含量的自动化测定，可以高通量、快速化、精确地测定生物样本中万古霉素与去甲万古霉素的含量，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，有效降低万古霉素与去甲万古霉素检测成本，有利于临床广泛推广使用。

【技术实现步骤摘要】
万古霉素衍生物及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医学检验领域，具体涉及万古霉素衍生物及其制备方法和应用，特别是涉及万古霉素衍生物、其制备方法及其在万古霉素与去甲万古霉素免疫检测试剂中的应用。
技术介绍
万古霉素(Vancomycin)是一种三环糖肽类抗生素，通过干扰细菌细胞壁结构中的关键组分肽聚糖来干扰细胞壁的合成，抑制细胞壁中磷脂和多肽的生成，其分子式为：C66H75C12N9O24，分子量是1485.74。万古霉素主要用于治疗革兰氏阳性细菌的感染，以及某些特殊的革兰氏阴性厌氧菌的感染，是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的一线用药。万古霉素在人体内基本不代谢，90％的剂量以原型药物通过肾脏排泄。万古霉素的半衰期一般约为6小时，主要经肾消除，相当于所给计量的90％在给药后24小时内从尿中排出。去甲万古霉素是我国研制生产的糖肽类抗生素，其化学结构、药理性质和抗菌作用与万古霉素相似，但治疗成本明显低于万古霉素。去甲万古霉素主要用于葡萄球菌(包括产酶株和耐甲氧西林株)、肠球菌(耐氨苄西林株)、难辨梭状芽胞杆菌等所致的系统感染和肠道感染，如心内膜炎、败血症，以及假膜性肠炎等。万古霉素与去甲万古霉素对耐药金黄色葡萄糖球菌和表皮葡萄球菌感染有很好的疗效，且不易诱导细菌产生耐药性。万古霉素与去甲万古霉素都具有一定耳毒性，及可能引发患者体内产生抗血小板抗体，引起血小板减少症以及由皮下红斑，瘀斑和紫癜引起的出血。此外，去甲万古霉素肾毒性较强，要尽量避免与其他肾毒性药物合用。对于合用肾损害药物(如氨基糖苷类药物)的患者、ICU患者、肥胖患者、烧伤患者、肾功能不全患者、儿童或老年患者、血液透析患者及合并肝疾病的患者，及时监测血清或血浆中万古霉素与去甲万古霉素水平，及时调整治疗剂量是至关重要的。目前检测万古霉素与去甲万古霉素的实验室方法主要有微生物测定法、放射免疫测定法(RIA)、荧光偏振免疫测定法(FPIA)、化学发光微粒子免疫检测法(CMIA)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)等。这些方法都有其不可回避的缺点，如HPLC法常因操作繁琐，效率低，测定周期长及分析成本高的缺点限制了其在临床药物浓度监测中的广泛应用。CN2012102751858公开了一种万古霉素半抗原及万古霉素胶体金免疫检测试剂条，该方法胶体金免疫检测试剂条不能用于全定量检测。CN2019100200000也公开一种万古霉素人工抗原，以及检测万古霉素的时间分辨荧光免疫层析试纸条，该人工抗原由万古霉素经高碘酸钠处理后直接与牛血清白蛋白偶联得到。该方法在万古霉素免疫检测中，采用的万古霉素人工抗原结构会直接决定其免疫原性，从而影响抗体的灵敏度和特异性，最终影响试剂的检测效果，而上述现有技术公开的万古霉素人工抗原均不能获得性能最佳的抗万古霉素特异性抗体，从而导致试剂的检测质量不佳。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的万古霉素与去甲万古霉素检测试剂，尤其是质量好的高通量自动化检验试剂。因此，研发一种质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的万古霉素与去甲万古霉素检测试剂已成为国内外治疗药物监测试剂行业的热点。
技术实现思路
为解决现有技术存在的上述问题，本专利技术目的是提供一种能够实现在全自动生化分析仪上对万古霉素与去甲万古霉素的高通量、快速化检测的的检测试剂，以满足国内日益增长的检测试剂使用需求。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：本专利技术第一方面提供了一种万古霉素衍生物，其结构式如下述式(Ⅰ)所示：其中，R1为连接基团，所述连接基团为-CO-(CH2)n-COOH、-(CH2)n-COOH、-O-(CH2)n-COOH、-S-(CH2)n-COOH、-NH-(CH2)n-COOH、-CS-(CH2)n-COOH、-(CH2)n-NH-COOH或中的一种；其中n为1至10之间的任意整数，所述1至10之间的任意整数包括1,2,3,4,5,6,7,8,9和10，进一步优选地，n为3。上述结构式如式(Ⅰ)所示的万古霉素衍生物中，优选地，所述连接基团R1为-CO-(CH2)n-COOH；其中n为1至10之间的任意整数，所述1至10之间的任意整数包括1,2,3,4,5,6,7,8,9和10，进一步优选地，n为3。进一步的，更优选，上述结构式如式(Ⅰ)所示的万古霉素衍生物中，所述连接基团R1为-CO-(CH2)3-COOH。在本专利技术的另一个优选实施方式中，提供了一种万古霉素衍生物，其结构式如式(II)所示：本专利技术第二方面还提供了一种结构式如式(Ⅰ)所示的万古霉素衍生物的制备方法，包括，将化合物1与能够引入上述连接基团R1的化合物R1-X反应，制备得到：上述方法中，优选地，将化合物1、化合物R1-X、三乙胺加入二甲基甲酰胺中溶解，将此溶液在室温下搅拌，得到的反应产物进行纯化，优选采用高效液相色谱进行浓缩和纯化，得到式(Ⅰ)所示的万古霉素衍生物，所述化合物R1-X为能够引入上述连接基团R1的相应有机酸或酸酐。进一步优选地，化合物1、化合物R1-X和三乙胺依次加入二甲基甲酰胺中溶解，其中，化合物1与化合物R1-X的摩尔比为1:1～1.5，优选1:1.1；化合物1与三乙胺的摩尔比为1:2～2.5，将此溶液在室温下搅拌适当的时间(例如10～12h)，得到的反应产物用高效液相色谱进行浓缩和纯化，得到式(Ⅰ)所示的万古霉素衍生物。进一步的，本专利技术提供一种式(Ⅱ)所示万古霉素衍生物的制备方法包括以下步骤：将化合物1、戊二酸酐和三乙胺加入到二甲基甲酰胺中溶解，将此溶液在室温下搅拌，反应结束后，将反应得到的反应产物纯化，得到式(Ⅱ)所示的万古霉素衍生物；优选地，反应结束后，将反应得到的反应产物用高效液相色谱进行浓缩和纯化；进一步优选地，化合物1与戊二酸酐的摩尔比为1:1～1.5，优选1:1.1；化合物1与三乙胺的摩尔比为1:2～2.5。在本专利技术的一个更具体的实施方式中，提供了一种式(II)所示万古霉素衍生物的制备方法，包括如下步骤：将5g化合物1、433mg戊二酸酐和697mg三乙胺依次加入5mL二甲基甲酰胺中溶解，将此溶液在室温下搅拌12小时，得到的反应产物用高效液相色谱进行浓缩和纯化，得到式(Ⅱ)所示的万古霉素衍生物。本专利技术第三方面，提供了一种万古霉素人工抗原，由前述结构式(I)所示万古霉素衍生物与载体连接而成，其结构式如式(Ⅲ)所示：其中，R2为连接基团，所述连接基团为-CO-(CH2)n-CO-、-(CH2)n-CO-、-O-(CH2)n-CO-、-S-(CH2)n-CO-、-NH-(CH2)n-CO-、-CS-(CH2)n-CO-、-(CH2)n-NH-CO-或中的一种；其中n均为1至10之间的任意整数，优选的，n为3。上述结构式(Ⅲ)中，进一步优选地，所述连接基团为-CO-(CH2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.万古霉素衍生物，其特征在于，所述万古霉素衍生物结构式如式(Ⅰ)所示：/n

【技术特征摘要】
1.万古霉素衍生物，其特征在于，所述万古霉素衍生物结构式如式(Ⅰ)所示：



其中，R1为连接基团，所述连接基团为-CO-(CH2)n-COOH、-(CH2)n-COOH、-O-(CH2)n-COOH、-S-(CH2)n-COOH、-NH-(CH2)n-COOH、-CS-(CH2)n-COOH、-(CH2)n-NH-COOH或中的一种；
优选地，所述连接基团为-CO-(CH2)n-COOH；
更优选地，所述连接基团为-CO-(CH2)3-COOH；
其中n为1至10之间的任意整数。


2.一种结构式如式(Ⅰ)所示的万古霉素衍生物的制备方法，其特征在于，由化合物1与能够引入连接基团R1的化合物R1-X反应，制备得到，包括以下步骤：



将化合物1、化合物R1-X、三乙胺加入二甲基甲酰胺中溶解，将此溶液在室温下搅拌，得到的反应产物进行纯化；
优选地，采用高效液相色谱进行浓缩和纯化，得到式(Ⅰ)所示的万古霉素衍生物，所述化合物R1-X为能够引入连接基团R1的相应有机酸或酸酐；
上述方法中，进一步优选地，化合物1、化合物R1-X和三乙胺依次加入二甲基甲酰胺中溶解，其中，化合物1与化合物R1-X的摩尔比为1:1～1.5，优选1:1.1；化合物1与三乙胺的摩尔比为1:2～2.5，将此溶液在室温下搅拌10～12h，得到的反应产物用高效液相色谱进行浓缩和纯化，得到式(Ⅰ)所示的万古霉素衍生物；
更优选地，所述万古霉素衍生物的结构式如式(II)所示：



进一步优选地，式(Ⅱ)所示万古霉素衍生物的制备方法包括以下步骤：



将化合物1、戊二酸酐和三乙胺加入到二甲基甲酰胺中溶解，将此溶液在室温下搅拌，反应结束后，将反应得到的反应产物纯化，得到式(Ⅱ)所示的万古霉素衍生物；
优选地，反应结束后，将反应得到的反应产物用高效液相色谱进行浓缩和纯化；
进一步优选地，化合物1与戊二酸酐的摩尔比为1:1～1.5，优选1:1.1；化合物1与三乙胺的摩尔比为1:2～2.5。


3.万古霉素人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述的万古霉素衍生物与载体连接而成，其结构式如式(Ⅲ)所示：



其中，R2为连接基团，所述连接基团为-CO-(CH2)n-CO-、-(CH2)n-CO-、-O-(CH2)n-CO-、-S-(CH2)n-CO-、-NH-(CH2)n-CO-、-CS-(CH2)n-CO-、-(CH2)n-NH-CO-或中的一种；
优选地，所述连接基团为-CO-(CH2)n-CO-；
更优选地，所述连接基团为-CO-(CH2)3-CO-；
其中n为1至10之间的任意整数；
所述载体为血清白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原、卵清蛋白、甲状腺球蛋白、血蓝蛋白、多聚赖氨酸中的一种，优选为血清蛋白，更优选为牛血清白蛋白。


4.抗万古霉素特异性抗体，其特征在于，由权利要求3所述的万古霉素人工抗原免疫实验动物后分离纯化得到。


5.根据权利要求4所述的抗万古霉素特异性抗体，其特征在于：所述的抗体为采用权利要求3所述的万古霉素人工抗原对实验动物加强免疫所获得的多克隆抗体；
或者，为采用权利要求3所述的万古霉素人工抗原免疫实验动物后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；
优选地，所述的宿主动物为兔、山羊、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或马中的一种。


6.一种万古霉素与去甲万古霉素免疫检测试剂，其特征在于，包含试剂R1，试剂R2和定标液，其中，
试剂R1：包含权利要求4-5任一项所述的抗万古霉素特异性抗体与R1缓冲液，所述R1缓冲液由牛血清白蛋白、葡萄糖-6-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与Tris缓冲液组成；
试剂R2：包含万古霉素酶标偶联物与R2缓冲液，所述万古霉素酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：虞留明，成志鹏，胡振阳，张英蕾，
申请(专利权)人：苏州博源医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32