一种液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法和用途，所述测定方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，其检测条件如下：色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为0.03～0.08mol/L磷酸二氢铵‑乙腈，流动相pH为3.0～3.5，柱温：23～28℃，进样量：5～15μL，进样浓度：0.0005～2mg/mL，流速：0.8～1.2mL/min，检测波长：236nm，梯度洗脱。本发明专利技术方法精密度高，重复性好，回收率高，可以广泛用于不同来源的小檗碱原料药及其对应制剂的质量检测。

【技术实现步骤摘要】
一种液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法
本专利技术属于药物分析领域，具体涉及通过高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法。
技术介绍
小檗碱(Berberine)，是多种小檗碱属植物茎、根中主要的异喹啉生物碱，具有括抗炎、抗菌、抗肿瘤、保护神经、降糖、降脂等作用，被用来治疗一系列疾病，如肠道感染，肠胃炎等。小檗碱化学式为5，6-二氢-9，10-二甲氧苯并[g]-1，3-苯并二氧戊环[5，6-α]喹嗪，分子式为C20H18NO4，分子量为336.37，小檗碱的结构式为：在小檗碱的生产和贮藏过程中，可能会由于起始物料和中间体去除不完全以及贮藏过程中生成的降解杂质而影响药物的纯度，这些影响药物纯度的物质称为有关物质。上述有关物质皆无治疗作用，还可能影响药物的稳定性和疗效，甚至危害人体健康。化合物原料药可通过合成或天然产物提取获得，而两者在杂质的种类以及数量上存在一定区别。本方案的小檗碱原料，采用合成的方法获得。小檗碱在生产和贮藏过程中，可产生以下盐酸药根碱、盐酸巴马汀和杂质1～7的杂质，其结构式和化学式等信息如下表所示：《中国药典2015年版》中关于盐酸小檗碱的有关物质的记载，使用高效液相色谱法(通则0512)试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH值至2.8)-乙腈(75:25)为流动相；检测波长为345nm，检查盐酸药根碱和盐酸巴马汀。岳清洪等人发表了《黄连的3D-HPLC特征指纹图谱研究》，该文献报导了一种液相方法，色谱柱为XtimateTMC18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为30mmol/L碳酸氢铵溶液(含0.1％三乙胺、0.7％氨水)-乙腈(梯度洗脱，(0～15min，10％→25％B；15～25min，25％→30％B；25～40min，30％→45％B))，检测波长为200～400nm，柱温为30℃，流速为1.0mL/min。用以标定木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸非洲防己碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱7种生物碱类成分。刘晶晶等人发表了《与黄连功能对应的5种药效组分分析》，该文献报导了一种液相方法，流动相为A相：30mmol/L碳酸氢氨水溶液(含有0.7％氨水，0.1％三乙胺)，B相：乙腈；线性洗脱程序为0～15min10％～20％B，15～20min20％～25％B，20～25min25％～30％B，25～40min30％～45％B，40～45min45％～10％B。检测波长356nm；进样量30μL，流速1mL/min；室温。用以分离分析盐酸药根碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马丁、盐酸小檗碱。冯友龙等人发表了一种小檗碱高效液相色谱法色谱条件的优化，具体的色谱柱：DiamondCl8柱、PhenomenexlunaC18柱、KromasilCl8柱等品牌效果较好，流动相：是磷酸盐缓冲液，20mmol/L的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠溶液，以磷酸调节pH值至一定数值(大多数为3.0～3.5，少有5.0者)，检测波长可选择265～270或345～350nm。药根碱和巴马汀是小檗碱的结构类似物，杂质1、杂质2、杂质6和杂质7是小檗碱在合成过程中容易引入的杂质，杂质3是小檗碱的异构体杂质，杂质4和杂质5是小檗碱碱性条件下的降解杂质。申请人发现，以上专利或文献只能部分分离测定小檗碱与其杂质，并不能实现同时分离测定小檗碱与该九个杂质，且目前尚未见关于小檗碱与该九个杂质的同时分离测定方法，本专利技术从现有技术的不足出发，提供一种分析方法，能够准确，快速分离测定小檗碱与该九个杂质，且该方法灵敏度高，线性范围宽，在日常生产中起到控制小檗碱的质量、提高药品疗效、降低毒副作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种通过高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法，该方法较现有技术公开的方法更具有普适性，表现为：采用该方法可以实现各杂质的同时分离，进而有利于实现对原料药或制剂中有关物质更准确的定性/定量分析，以及有利于实现对原料药或制剂在制备、贮存过程中潜在可能产生的未知杂质的有效质量控制。本专利技术的上述目的通过以下技术方案予以实现：本专利技术公开了一种通过高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法，所述测定方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，其检测条件如下：流动相：A相：0.03～0.08mol/L磷酸二氢铵，用磷酸调节pH值至3.0～3.5B相：乙腈柱温：23～28℃进样量：5～15μL进样浓度：0.0005～2mg/mL流速：0.8～1.2mL/min检测波长：236nm所述测定方法包含以下步骤：1)配制样品溶液：使用初始配比流动相配制含小檗碱及其杂质各0.0005～2mg/mL的溶液；2)进样；3)采用梯度洗脱法洗脱；4)记录色谱图并进行分析。所述高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法中梯度洗脱的设置是实现检测效果的重要技术关键。具体的，研究人员发现0至15min时使用等度洗脱可以有效分离杂质2和盐酸药根碱，但保持等度洗脱的情况下，无法分离其余的杂质，杂质各峰之间存在重合、包覆或者峰型不佳的现象，不利于杂质的定性及定量检测，因此在0至15min等度洗脱后，分梯度逐渐增加流动相的极性，最后洗脱较强保留的杂质，并保证相关洗脱峰的峰型及各峰的分离度，所述梯度洗脱设置如下：阶段VA相：VB相洗脱时间080:20～75:250min180:20～75:250-15min275:25～60:402-5min360:40～50:503-7min450:50～35:6515-20min550:50～35:655-15min上述梯度洗脱设置中，所述洗脱时间指代该阶段洗脱所持续的时长，流动相的比例(VA相：VB相)指代到达该洗脱时间终点时流动相的比例，其中阶段0指代流动相的起始比例，即：在该洗脱时间段内，流动相的比例由前一个时间段的终点值变至本时间段的终点值，如无特指，本专利技术中所有梯度设置的解释均遵从于此。优选的，流动相的比例在洗脱时间内为匀速改变。更具体的，上述梯度洗脱流动相的比例(VA相：VB相)为以下比例时，有利于较优的分离效果，如下：阶段VA相：VB相洗脱时间077:230min177:239min265:352min355:454min4...

【技术保护点】
1.一种通过高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法，所述测定方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，其检测条件如下：/n流动相：/nA相：0.03～0.08mol/L磷酸二氢铵，用磷酸调节pH值至3.0～3.5；/nB相：乙腈/n柱温：23～28℃/n进样量：5～15μL/n进样浓度：0.0005～2mg/mL/n流速：0.8～1.2mL/min/n检测波长：236nm/n所述测定方法包含以下步骤：/n1)配制样品溶液：使用初始配比流动相配制含小檗碱及其杂质各0.0005～2mg/mL的溶液；/n2)进样；/n3)采用梯度洗脱法洗脱；/n4)记录色谱图并进行分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种通过高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法，所述测定方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，其检测条件如下：
流动相：
A相：0.03～0.08mol/L磷酸二氢铵，用磷酸调节pH值至3.0～3.5；
B相：乙腈
柱温：23～28℃
进样量：5～15μL
进样浓度：0.0005～2mg/mL
流速：0.8～1.2mL/min
检测波长：236nm
所述测定方法包含以下步骤：
1)配制样品溶液：使用初始配比流动相配制含小檗碱及其杂质各0.0005～2mg/mL的溶液；
2)进样；
3)采用梯度洗脱法洗脱；
4)记录色谱图并进行分析。


2.根据权利要求1所述的通过高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法，其特征在于，所述的色谱柱为YMCTriartC18色谱柱(4.6mm×150mm，3μm)。


3.根据权利要求1所述的通过高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法，其特征在于，所述流动相还含1.0％三乙胺，所述流动相中磷酸二氢铵浓度为0.05mol/L。


4.根据权利要求1所述的通过高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法，其特征在于，所述pH值为用磷酸调节pH值至3.2。


5.根据权利要求1所述的通过高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法，其特征在于，在所述梯度洗脱法洗脱中，洗脱梯度为：








6.根据权利要求5所述的通过高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法，其特征在于，在所述梯度洗脱法洗脱中，洗脱梯度为：









阶段
VA相：VB相
洗脱时间


0
77:23
0min


1
77:23
9min


2
65:35
2min


3
55:45
4min


4
40:60
20min


5
40:60
15min

【专利技术属性】
技术研发人员：顾云，程志伟，杨晓敏，
申请(专利权)人：广东华南药业集团有限公司，广东众生药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44