一种免疫增强剂及其在禽流感疫苗中的应用制造技术

本发明专利技术公开了免疫增强剂，其包含黑木耳多糖和禽流感疫苗，通过黑木耳多糖与禽流感疫苗配合使用，在效果上起协同作用，可增强禽流感疫苗的活性，获得理想的免疫效果。采用本发明专利技术的免疫增强剂的禽流感疫苗在整个免疫周期内，相比于没有添加佐剂的禽流感疫苗，其免疫表达的抗体滴度会显著提高。

【技术实现步骤摘要】
一种免疫增强剂及其在禽流感疫苗中的应用
本专利技术涉及一种免疫增强剂，及其在禽流感疫苗中的应用。
技术介绍
呼吸道是流感病毒入侵的门户，在呼吸道黏膜建立特异性免疫保护能阻止病毒的侵入。减毒活疫苗是现在临床上唯一的经黏膜免疫的流感疫苗种类，该疫苗通过鼻腔免疫在病毒入侵部位诱导产生强烈的SIgA抗体应答，阻止流感病毒进入体内。但是，减毒活疫苗有其局限性，仅推荐5-49岁的人接种，只在少数几个国家批准使用。流感灭活疫苗包括全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗，是在全球范围批准使用的疫苗类型，通过肌肉注射的方式接种，主要通过诱导系统性IgG抗体提供特异性保护，不能诱导产生SIgA。近年来，研究表明流感灭活疫苗经鼻免疫也是有效的，但需要黏膜佐剂来提升其免疫保护效果。流感病毒灭活疫苗的佐剂目前常用的有无机佐剂（如铝佐剂）、表面活性剂（如MF59）、细胞因子佐剂（如IFN-γ）及多糖类佐剂等。天然多糖广泛存在于自然界，具有多种生物活性，有些天然多糖能调节多种免疫细胞和免疫分子，增强机体的抵抗力，还具有抗肿瘤的作用，近年来作为佐剂研究对象受到了广泛关注。玉竹多糖（POP）具有佐剂效应成分，主要从百合科植物玉竹根茎中提取。张亚楠等将H7N9流感病毒裂解疫苗与不同剂量的POP作为佐剂滴鼻免疫BALB／c小鼠模型，结果表明，POP可增强免疫应答，具有黏膜佐剂效应，血清中特异性IgG抗体和HI抗体呈增加趋势。单俊杰等研究结果显示蓝根总多糖（IIP）有佐剂活性。H1N1流感病毒裂解液与多糖IIP-A-1联用，能显著提高IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA的滴度水平，同时B细胞的增殖能力显著高于无佐剂组，IIP-A佐剂有促进Th1细胞分化的能力，脾淋巴细胞分泌IFNγ的能力也得到进一步增强。谢国秀等将低剂量灭活疫苗联合200μg剂量的茯苓多糖给药，表明能提高抗体水平，但无法抵抗致死量流感病毒的攻击；当茯苓多糖剂量升至1000μg时，低剂量疫苗组小鼠抗体水平显著增加，血清IgG滴度显著高于无佐剂组。综上所述，虽然目前已有文献报道了多种多糖用于流感病毒疫苗的免疫增强剂，但是开发新的天然无毒的多糖类免疫增强剂仍然具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术第一方面：提供一种免疫增强剂，其是以天然多糖与禽流感疫苗配合使用，能够增强机体免疫功能。黑木耳是我国珍贵的药食兼用真菌，其钙、铁、磷等元素含量高，具有清洁肠胃、降血糖、降血脂、抗癌、抗衰老和增强人体生理活性等功效。其中黑木耳多糖（简称AA多糖）降血脂功效与其结构间的关系成为近年来研究的热点。DavidL.Hawksworth等人研究了食用菌的微观结构。王晓云初步研究了黑木耳保健食品的开发。本专利技术利用现有技术中报道的黑木耳多糖，结合之前报道的部分多糖具有免疫增强的效果，创造性地将黑木耳多糖用作禽流感疫苗的免疫增强剂，取得了良好的效果。为解决本专利技术的技术问题，本申请提供了一种提供一种免疫增强剂，其以黑木耳多糖作为主要成分，所述黑木耳多糖的制备方法如下：将黑木耳原料去杂质，用毛刷清理干净。在粉碎机中初步粉碎得到粗粉，在球磨机中微粉碎得到细粉，最后在超细粉碎振动磨中超微粉碎。用振动筛筛分得到黑木耳超微粉。将黑木耳超微粉在85℃、料液比1∶160、pH6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中浸提4.5h，离心，取上清液，用Sevage法脱蛋白，离心弃沉淀，上清液用氨水调pH值至8.0。加入上清液体积30%的质量分数为20%H2O2，40℃条件下振荡脱色3h，再用95%乙醇沉淀，透析，冻干得黑木耳超微粉粗多糖。将黑木耳超微粉粗多糖溶解后过纤维素DEAE-52离子交换树脂柱纯化。离子交换柱Φ20×400mm。得到纯化的黑木耳多糖。本专利技术的另一方面提供一种黑木耳多糖作为禽流感疫苗免疫增强剂的用途，将本专利技术所述黑木耳多糖与禽流感疫苗联用，能够增强疫苗的免疫活性。优选地，所述禽流感疫苗为H9N2亚型禽流感疫苗。本专利技术的另一方面提供一种免疫增强剂用于增强禽流感疫苗免疫活性的用途，其特征在于：将黑木耳多糖与禽流感疫苗联用，达到增强疫苗的免疫活性。根据前述的用途，优选地，所述禽流感疫苗为H9N2亚型禽流感疫苗。本专利技术的另一方面提供一种按照前面所述的方法制备得到的黑木耳多糖，其能够增强禽流感疫苗的免疫应答，起到协同增效的作用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术采用一种免疫增强剂，其以天然黑木耳多糖作为活性增效成分，与禽流感疫苗配合使用，在效果上起协同作用，可增强禽流感疫苗的活性，获得理想的免疫效果。具体来说，采用本专利技术的免疫增强剂的禽流感疫苗在整个免疫周期内，相比于没有添加免疫增强剂的禽流感疫苗，其免疫表达的抗体滴度会显著提高。具体实施方式下面通过实施例来具体说明本专利技术的内容。在本专利技术中，以下实施例是为了更好地阐述本专利技术，并不是用来限制本专利技术的范围。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1H9N2亚型禽流感疫苗免疫增强剂：步骤一：制备黑木耳多糖水溶液：取15g黑木耳多糖加入85ml水中，搅拌至溶解，即得黑木耳多糖水溶液（即黑木耳多糖含量为15wt%）。步骤二：配置油相：分别取56ml白油和4ml司本-80，将二者混合均匀。步骤三：配置水相：分别取35mlH9N2胚液灭活抗原(107EID50/0.1mL，肇庆大华农生物药品有限公司)、1.7ml吐温-80和3.3ml步骤一制备得到的贝怡多糖水溶液，混合均匀。步骤四：制备免疫增强剂：将油相和水相混合，配成制剂（200羽份）。实施例2H9N2亚型禽流感疫苗免疫增强剂：其大体同实施例1，其中步骤1中黑木耳多糖含量为10wt％。实施例3H9N2亚型禽流感疫苗免疫增强剂：其大体同实施例1，其中步骤1中黑木耳多糖含量为20wt％。对比例1H9N2亚型禽流感疫苗：其大体同实施例1，其中步骤1中不加入黑木耳多糖。其中上述黑木耳多糖的制备方法如下：将黑木耳原料去杂质，用毛刷清理干净。在粉碎机中初步粉碎得到粗粉，在球磨机中微粉碎得到细粉，最后在超细粉碎振动磨中超微粉碎。用振动筛筛分得到黑木耳超微粉。将黑木耳超微粉在85℃、料液比1∶160、pH6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中浸提4.5h，离心，取上清液，用Sevage法脱蛋白，离心弃沉淀，上清液用氨水调pH值至8.0。加入上清液体积30%的质量分数为20%H2O2，40℃条件下振荡脱色3h，再用95%乙醇沉淀，透析，冻干得黑木耳超微粉粗多糖。将黑木耳超微粉粗多糖溶解后过纤维素DEAE-52离子交换树脂柱纯化。离子交换柱Φ20×400mm。得到纯化的黑木耳多糖。实施例4体外活性测试1、H9N2亚型禽流感疫苗免疫试验1.1动物实验分组将40只7日龄SPF鸡随机分为四组，每组10只：A：实施例1制得的H9N2亚型灭活禽流本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫增强剂，其包含黑木耳多糖和禽流感疫苗。/n

【技术特征摘要】
1.一种免疫增强剂，其包含黑木耳多糖和禽流感疫苗。


2.根据权利要求1所述的免疫增强剂，其特征在于：
所述黑木耳多糖的制备方法为：将黑木耳原料去杂质，用毛刷清理干净；在粉碎机中初步粉碎得到粗粉，在球磨机中微粉碎得到细粉，最后在超细粉碎振动磨中超微粉碎；用振动筛筛分得到黑木耳超微粉；将黑木耳超微粉在85℃、料液比1∶160、pH6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中浸提4.5h，离心，取上清液，用Sevage法脱蛋白，离心弃沉淀，上清液用氨水调pH值至8.0；加入上清液体积30%的质量分数为20%H2O2，40℃条件下振荡脱色3h，再用95%乙醇沉淀，透析，冻干得黑木耳超微粉粗多糖；
将黑木耳超微粉粗多糖溶解后过纤维素DEAE-52离子交换树脂柱纯化，离子交换柱Φ20×400mm，得到纯化的黑木耳多糖。


3.根据权利要求1所述的免疫增强剂，其特征在于：所述禽流感疫苗为H9N2亚型禽流感疫苗。


4.一种免疫增强剂用于增强禽流感疫苗免疫活性的用途，其特征在于：所述免...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文炎，高艳，刘锦容，詹烜子，刘之文，黎啟林，刘德城，
申请(专利权)人：肇庆大华农生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44