一种带负电荷的纳米粒作为免疫调节剂的应用制造技术

本发明专利技术属于海洋生物技术，具体涉及一种带负电荷的纳米粒(壳聚糖衍生物)在作为调节免疫剂(激活DCS细胞NF‑κB蛋白表达)中的应用。通过聚电解质复合法，将不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物和不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物，在室温磁力搅拌,获得粒径192.7nm‑334.2nm、电位(‑13.2)mV‑(‑28.2)mV的带负电荷的壳聚糖衍生物纳米粒。所述制备表面带负电荷的壳聚糖衍生物纳米粒，并对其免疫活性进行测定。为近年来壳聚糖作为免疫佐剂的研究提供一定的方法和理论指导。

【技术实现步骤摘要】
一种带负电荷的纳米粒作为免疫调节剂的应用
本专利技术属于海洋生物技术，具体涉及一种带负电荷的纳米粒(壳聚糖衍生物)在作为调节免疫剂(激活DCS细胞NF-κB蛋白表达)中的应用。
技术介绍
纳米粒的研究是近年来研究热点之一，利用纳米粒作为药物载体是目前医学上多种药物的重要研究方向。纳米粒所带电性对其性质具有重要影响，很大程度上决定着纳米粒发挥作用的效果和机理。在之前的研究中，证明带有正电荷的纳米粒具有较好免疫效果。而带有负电荷的纳米粒在作为免疫佐剂方面应用尚无研究。其作用效果和作用机理都有待于进一步证明。壳聚糖本身难溶于水，特别是分子量较大的情况下，将其进行衍生化，提高其水溶性，对于其研究较多但是衍生化后将其作为原料进行纳米粒制备的研究并不完善。以往研究中作为免疫载体或者疫苗佐剂的纳米粒主要为正电荷纳米粒，主要是由于传统方法使用交联剂(如：戊二醛、三聚磷酸钠)等进行纳米粒制备，利用壳聚糖本身带有正电性加入少量带有负电行交联剂制备出带有正电性纳米粒。过量交联剂的加入必然降低纳米粒安全性，从而大大缩小其应用范围。因此负电荷纳米粒的制备一直有所限制。
技术实现思路
本专利技术考虑以上问题，提供一种带负电荷的纳米粒在作为调节免疫活性(激活DCS细胞NF-κB蛋白表达)中的应用。为实现上述目的，本实验采用的技术方案为：一种带负电荷的纳米粒的制备，通过聚电解质复合法，将不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物和不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物，在室温以500r-700r/min磁力搅拌20-40min,获得粒径192.7nm-334.2nm、电位(-13.2)mV-(-28.2)mV的带负电荷的壳聚糖衍生物纳米粒，过滤并于4℃保存；所述不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物和不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物按质量比为2-5：1-3的比例混合。所述不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物为不同分子量不同取代位点的壳聚糖硫酸酯；不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物为不同分子量的壳聚糖季铵盐；其中，具有相近分子量壳聚糖季铵盐和壳聚糖硫酸酯作为同一组进行纳米粒制备。所述不同分子量不同取代位点的壳聚糖硫酸酯的分子量为200kDa或50kDa不同取代位点的壳聚糖硫酸酯：所述取代位点为均为C2,3,6-位、C6-位、C3,6-位、C3-位、C2-位,C2,3-位或C2,6-位的壳聚糖硫酸酯；所述不同分子量的壳聚糖季铵盐为分子量为50kDa或200kDa的2、3-环氧丙基三甲基氯化铵壳聚糖。一种带负电荷的纳米粒为调节免疫活性中的应用，所述带负电荷的纳米粒在包裹抗原后能够激活DCS细胞NF-κB蛋白表达的佐剂中的应用。所述包裹抗原的带负电荷的纳米粒具有激活DCS细胞NF-κB蛋白表达的作用；其中，负电荷壳聚糖衍生物纳米粒与抗原按质量比为0.5-2：1。一种调节免疫活性的制剂，制剂为抗原和佐剂，其中，佐剂与抗原质量比为0.5-2：1；所述佐剂为权利要求1制备所得带负电荷的纳米粒。将正电荷衍生物和抗原混合均匀，后加入负电荷衍生物，通过静电吸附作用抗原包裹于其中，制备包裹抗原的纳米材料，即调节免疫活性的制剂。所述抗原为常用标准抗原OVA及灭活病毒或灭活病毒蛋白等。进一步的说，利用所述壳聚糖衍生物纳米粒，采用对树突状细胞的免疫活性进行测定。通过对未包裹抗原纳米粒的细胞毒性测定，确定其对细胞无毒的纳米粒最大浓度为100μg/mL。通过对免疫因子表达量和细胞免疫因子分泌量的测定，优选分子量均为50kDa和200kDa的C2,3,6位取代硫酸酯壳聚糖及50kDa的C6位取代硫酸酯壳聚糖作为负离子壳聚糖衍生物，季铵盐壳聚糖作为正离子壳聚糖衍生物，此时制备纳米粒条件硫酸酯壳聚糖浓度为1.5mg/mL，季铵盐浓度为1.0mg/mL，纳米粒具有最好的免疫效果。本专利技术所具有的优点：1.本专利技术使用壳聚糖的带有正负电荷衍生物，在不引入交联剂的条件下进行纳米粒的制备，该方法去除了交联剂的毒副作用，保证其在生物体内的安全，经细胞毒性试验检测，其在适当的浓度下，具有生物安全性。2.本专利技术所制备的纳米粒带有负电荷，不同于以往多数用于免疫佐剂的纳米粒为正电荷，且表现出更高的免疫活性；进一步的说纳米粒表面带有负电荷，更利于与细胞结合及进入细胞内，从而释放所包裹的抗原或目标蛋白等物质，同时将其使用于小鼠DCS细胞进行免疫效果验证，结果表明多数纳米粒能够促进小鼠四种细胞因子的表达及分泌量，证明所制备纳米粒具有一定免疫效果。3.本专利技术通过蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即WesternBlot方法测定纳米粒对DCS细胞NF-κB蛋白家族中p65蛋白水平的影响，表明纳米粒有利于激活并促进NF-κB蛋白表达，推测有可能通过TLR4-NF-κB通路激活树突细胞，在制备高效且无副反应免疫佐剂及其后续机理研究方面具有很好的指导意义。附图说明图1A、图1B为本专利技术实施例1中获得的不同分子量壳聚糖的分子量测定结果的HPLC图谱；其中，A为200kDa、B为50kDa。图2为本专利技术实施例3中获得的壳聚糖季铵盐(HACC)和不同位点壳聚糖硫酸酯衍生物的红外图谱。图3为本专利技术实施例4中获得的壳聚糖衍生物纳米粒的电位(A)和粒径(B)表征图。图4为本专利技术实施例4中获得的壳聚糖衍生物纳米粒的扫描电镜图。图5为本专利技术实施例6中获得的纳米粒促进DC细胞中NF-κB蛋白分泌量图。具体实施方式下面结合说明书附图对本专利技术作进一步说明，并且本专利技术的保护范围不仅局限于以下实施例。本专利技术以壳聚糖为基础，进行纳米粒的制备并对其免疫活性进行测定，最终得具有免疫佐剂作用的壳聚糖衍生物纳米粒。具体方法如下：将两种分子量不同取代位点的带有壳聚糖负电荷的衍生物和两种分子量季铵盐衍生物通过聚电解质复合法进行纳米粒的制备获得带负电荷的纳米粒；同时通过细胞实验，将能够引起机体免疫反应的物质包裹于得出带负电荷的纳米粒内，获得具有最佳免疫活性的壳聚糖衍生物纳米粒，由以上原料和条件下所制备的物质，无毒副作用，且经过小鼠树突细胞实验证明能够促进树突细胞IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ四种免疫因子基因表达量的提高，且促进了这四类细胞因子分泌量的增加。通过WesternBlot方法测定纳米粒对DCS细胞NF-κB蛋白分泌的影响，表明纳米粒有利于激活并促进NF-κB蛋白表达，其可能通过TLR4-NF-κB通路激活树突细胞，为近年来壳聚糖衍生物作为免疫佐剂的研究提供一定的方法和指导。实施例1不同分子量壳聚糖的制备取6g分子量为1820kDa原料壳聚糖加入98mLH2O，2mL醋酸，45℃条件下，搅拌速度为200r/min，搅拌1h后向其中加入壳聚糖酶(为于山东卫康生物医药科技有限公司所提供，壳聚糖降解酶)0.5g，1h后测定其分子量为57kDa的壳聚糖。而分子量为200kDa壳聚糖为购买所得，降解得到样品及购买所得样品均本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种带负电荷的纳米粒的制备，其特征在于：通过聚电解质复合法，将不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物和不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物，在室温以500r-700r/min磁力搅拌20-40min,获得粒径192.7nm-334.2nm、电位(-13.2)mV-(-28.2)mV的带负电荷的壳聚糖衍生物纳米粒，过滤并于4℃保存；所述不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物和不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物按质量比为2-5：1-3的比例混合。/n

【技术特征摘要】
1.一种带负电荷的纳米粒的制备，其特征在于：通过聚电解质复合法，将不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物和不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物，在室温以500r-700r/min磁力搅拌20-40min,获得粒径192.7nm-334.2nm、电位(-13.2)mV-(-28.2)mV的带负电荷的壳聚糖衍生物纳米粒，过滤并于4℃保存；所述不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物和不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物按质量比为2-5：1-3的比例混合。


2.按权利要求1所述的带负电荷的纳米粒的制备，其特征在于：所述不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物为不同分子量不同取代位点的壳聚糖硫酸酯；不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物为不同分子量的壳聚糖季铵盐。


3.按权利要求2所述的具有增强免疫活性的负电荷壳聚糖衍生物纳米粒的制备方法，其特征在于：所述不同分子量不同取代位点的壳聚糖硫酸酯的分子量为200kDa或50kDa不同取代位点的壳聚糖硫酸酯：
所述取代位点为均为C2,3,6-位、C6-位、C3,6-位、C3-位、C2-位,C...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢荣娥，徐超杰，刘松，秦玉坤，李克成，杨皓月，于华华，李鹏程，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37