一种β冠状病毒抗原、其制备方法和应用技术

本发明专利技术实施例涉及一种β冠状病毒抗原、其制备方法和应用。β冠状病毒抗原的氨基酸序列包括：按照(A‑B)‑(A‑B)样式排列的氨基酸序列或(A‑B)‑C‑(A‑B)样式排列的氨基酸序列或(A‑B)‑(A‑B’)样式排列的氨基酸序列或(A‑B)‑C‑(A‑B’)样式排列的氨基酸序列，所述β冠状病毒抗原为单链二聚体结构。本发明专利技术实施例所表达的单链二聚体含量稳定，作为β冠状病毒抗原具有好的免疫原性，该单链二聚体作为β冠状病毒抗原制备成的疫苗能够激发小鼠产生很高滴度的中和抗体。

【技术实现步骤摘要】
一种β冠状病毒抗原、其制备方法和应用
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种β冠状病毒抗原、其制备方法和应用。
技术介绍
冠状病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，是有囊膜的正链RNA病毒，在所有RNA病毒中其基因组最大，动物和人类都是冠状病毒的宿主。冠状病毒主要感染哺乳动物和鸟类的呼吸道和消化道，目前已知的有7种冠状病毒感染人，其中四种引起不严重的感冒(HCoV-229E,HCoV-NL63,OC43和HKU1)，对全球公共卫生威胁最大的有三种，分别是2002-2003年爆发的严重呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)；2012年爆发并持续至今的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)；以及2019年暴发的新型冠状病毒(2019-nCoV)，这三种都属于β冠状病毒。中东呼吸综合征(MERS)是由中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染所致的疾病。2012年6月沙特阿拉伯发现第一例MERS病例，并从病例痰液标本中分离到一种新的冠状病毒。这种病毒随后被国际病毒分类委员会冠状病毒小组命名为MERS-CoV。这种病毒在中东地区传播开来，并传至亚洲，非洲，欧洲和北美洲等地。据WHO统计，截止到2015年10月6日，在世界范围内，感染人数1589例，死亡人数567例，死亡率为35.6％(http://www.who.int/entity/emergencies/mers-cov/en/)。尤其是2015年5、6月间由中东输入到韩国的MERS疫情，造成了186人感染，36人死亡的结果。甚至有1例MERS病例输入到我国，给世界公共卫生体系带来了严重威胁。MERS-CoV病毒和2003年爆发的SARS病毒同属于Beta-冠状病毒亚属，却有着比SARS-CoV更高的致死率。MERS-CoV可能通过气溶胶的形式传播，因此很难防控。在中东许多国家的单峰驼的血清里能检测出MERS-CoV的中和抗体，提示单峰驼是MERS-CoV的中间宿主，而单峰驼在中东国家是重要的交通工具。因此，从2012年MERS-CoV被发现以来，在中东地区偶发性的MERS-CoV感染人事件一直没有中断。由此，随着国际交流的日益频繁，MERS在全球传播的风险一直存在。目前世界上仍然没有疫苗和有效的治疗手段。因此，开发一种安全、有效的针对MERS-CoV的疫苗十分紧迫和重要。2019年，出现了不明原因的肺炎病例，经过病毒的电镜图鉴定，确定是冠状病毒，暂时命名为2019新型冠状病毒(2019novelcoronavirus，2019-nCoV)，后又被命名为SARS-CoV-2。新型冠状病毒可以通过呼吸道和飞沫途径在人与人之间传播，也存在通过空气和消化道传播的可能。传染源主要是感染了新型冠状病毒的患者，但是不排除无症状的感染者也是传播源的可能，感染该病毒后可能不会立即发病，病毒的潜伏期较长，1-14天，这对疾病的防控造成困难。新型冠状病毒进入人体后，和SARS类似，通过血管紧张素转酶2(ACE2)进入细胞，感染人体，导致病人出现发烧，干咳以及肌肉疼等临床症状，少数人还会出现鼻塞，咽痛，腹泻等症状，严重的患者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍，造成生命危险。暂时还没有特异性药物，也没有疫苗可以预防，只能使用对症支持治疗。此外，一些其他的冠状病毒也引发许多严重的动物疾病，尤其对农业牲畜和宠物带来严重威胁。比如，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)可以引发猪的严重腹泻，死亡率极高；其缺失病毒猪呼吸道冠状病毒(PRCV)可以引起猪严重的呼吸道疾病；猫腹膜炎病毒(FIPV)可引起猫腹膜炎和腹水聚集，致死率很高；犬冠状病毒(CCoV)则可使犬发生不同程度的肠胃炎症状，传播快，难控制；猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起猪流行性腹泻等肠道疾病，容易在猪群里传播致死率很高。此外还有鼠、牛等冠状病毒。这些冠状病毒对人和动物的健康造成了严重的威胁。因此，开发针对冠状病毒的疫苗有着重要的意义。表面刺突蛋白(S蛋白)是冠状病毒的主要中和抗原。MERS-CoV、SARS-CoV、2019-nCoV的S蛋白的受体结合区(ReceptorBindingDomain,RBD)被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要的抗原靶区域。RBD作为疫苗能够将机体刺激产生的中和抗体更加聚焦在针对病毒的受体结合，可以提高疫苗的免疫原性和免疫效率。MERS-CoV通过RBD与宿主细胞的受体(CD26，又名DPP4)结合而侵入细胞。此外，SARS-CoV和2019-nCoV都发现通过其RBD与宿主细胞受体hACE2结合而进入细胞。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术的目的在于提供一种β冠状病毒抗原、其制备方法和应用。本专利技术实施例中基于MERS二聚体RBD蛋白比单体RBD蛋白能更好的的激发中和抗体的结论，尝试将两段编码相同或基本相同的单体RBD蛋白的核苷酸序列直接串联或通过连接段串联，所表达的两个相同或基本相同的单体RBD蛋白通过N端和C端的柔性区串联起来，结果显示该种方法可以很好地实现单链RBD二聚体的表达。相对于2个RBD单体简单通过其中的半胱氨酸以二硫键结合所形成的非单链形式的二聚体RBD蛋白而言，本专利技术实施例所得单链二聚体RBD蛋白不会因为二硫键的形成不稳定而导致生产过程中二聚体RBD蛋白含量不稳定，即避免以单体RBD形式为主，少有二聚体RBD形成的表达情况，从而使二聚体RBD表达稳定，形式均一，产量大大提高。相对于2个RBD单体简单通过其中的半胱氨酸以二硫键结合所形成的二聚体RBD蛋白而言，本专利技术实施例所表达的单链二聚体作为β冠状病毒抗原具有相当的免疫原性，该单链二聚体作为β冠状病毒抗原制备成的疫苗能够激发小鼠产生很高滴度的中和抗体。解决方案为实现本专利技术目的，本专利技术实施例提供了以下技术方案：一种β冠状病毒抗原，其氨基酸序列包括：按照(A-B)-(A-B)样式排列的氨基酸序列或(A-B)-C-(A-B)样式排列的氨基酸序列或(A-B)-(A-B’)样式排列的氨基酸序列或(A-B)-C-(A-B’)样式排列的氨基酸序列，其中：A-B表示β冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列，C表示连接氨基酸序列，A-B’表示A-B中的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，A-B’编码的蛋白质具有与A-B所编码的蛋白质相同或基本相同的免疫原性，所述β冠状病毒抗原为单链二聚体结构。可选地，β冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列为β冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区的全部氨基酸序列的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％。上述β冠状病毒抗原在一种可能的实现方式中，所述β冠状病毒包括：严重呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒和2019新型冠状病毒(2019新型冠状病毒也可称为2019-nCoV或者SARS-Co本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种β冠状病毒抗原，其特征在于：其氨基酸序列包括：按照(A-B)-(A-B)样式排列的氨基酸序列或(A-B)-C-(A-B)样式排列的氨基酸序列或(A-B)-(A-B’)样式排列的氨基酸序列或(A-B)-C-(A-B’)样式排列的氨基酸序列，其中：A-B表示β冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列，C表示连接氨基酸序列，A-B’表示A-B中的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，A-B’编码的蛋白质具有与A-B所编码的蛋白质相同或基本相同的免疫原性，所述β冠状病毒抗原为单链二聚体结构。/n

【技术特征摘要】
20200210 CN 20201008503891.一种β冠状病毒抗原，其特征在于：其氨基酸序列包括：按照(A-B)-(A-B)样式排列的氨基酸序列或(A-B)-C-(A-B)样式排列的氨基酸序列或(A-B)-(A-B’)样式排列的氨基酸序列或(A-B)-C-(A-B’)样式排列的氨基酸序列，其中：A-B表示β冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列，C表示连接氨基酸序列，A-B’表示A-B中的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，A-B’编码的蛋白质具有与A-B所编码的蛋白质相同或基本相同的免疫原性，所述β冠状病毒抗原为单链二聚体结构。


2.根据权利要求1所述的β冠状病毒抗原，其特征在于：所述β冠状病毒包括：严重呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒和2019新型冠状病毒。


3.根据权利要求1所述的β冠状病毒抗原，其特征在于：所述连接氨基酸序列包括：(GGS)n连接序列，其中n表示GGS的个数，n为≥1的整数；可选地，n为选自1-10的整数；进一步可选地，n为选自1-5的整数。


4.根据权利要求1所述的β冠状病毒抗原，其特征在于：β冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列为β冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区的全部氨基酸序列的至少50％、60％、70％、80％、90％、99％。


5.根据权利要求1所述的β冠状病毒抗原，其特征在于：
当β冠状病毒为中东呼吸综合征冠状病毒时，其表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列选自包括以下氨基酸序列的任意一种：
(1)SEQIDNO：1，SEQIDNO：2，或SEQIDNO：3；
(2)在(1)中的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，该氨基酸序列编码的蛋白质具有与(1)所编码的蛋白质相同或基本相同的免疫原性；
可选地，其表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列包括SEQIDNO：2；
当β冠状病毒为2019新型冠状病毒时，其表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列选自包括以下氨基酸序列的任意一种：
(3)SEQIDNO：5，SEQIDNO：6，或SEQIDNO：7；
(4)在(3)中的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，该氨基酸序列编码的蛋白质具有与(3)所编码的蛋白质相同或基本相同的免疫原性；
可选地，其表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列包括SEQIDNO：6；
当β冠状病毒为严重呼吸综合征冠状病毒时，其表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列选自包括以下氨基酸序列的任意一种：
(5)SEQIDNO：8；
(6)在(5)中的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，该氨基酸序列编码的蛋白质具有与(5)所编码的蛋白质相同或基本相同的免疫原性。


6.根据权利要求5所述的β冠状病毒抗原，其特征在于：
当β冠状病毒为中东呼吸综合征冠状病毒时，β冠状病毒抗原的氨基酸序列包括选自以下氨基酸序列的任意一种：
(1)通过GGSGGS连接序列串联起来的2个重复SEQIDNO：1氨基酸序列；
(2)通过GGS连接序列串联起来的2个重复SEQIDNO：1氨基酸序列；
(3)直接串联的2个重复SEQIDNO：1氨基酸序列；
(4)通过GGS连接序列串联起来的2个重复SEQIDNO：2氨基酸序列；
(5)直接串联的2个重复SEQIDNO：2氨基酸序列；
(6)通过GGSGGSGGSGGSGGS连接序列串联起来的2个重复SEQIDNO：3氨基酸序列；
(7)通过GGSGGSGGSGGS连接序列串联起来的2个重复SEQIDNO：3氨基酸序列；
(8)通过GGSGGSGGS连接序列串联起来的2个重复SEQIDNO：3氨基酸序列；
(9)通过GGS连接序列串联起来的2个重复SEQIDNO：3氨基酸序列；
(10)直接串联的2个重复SEQIDNO：3氨基酸序列；
可选地，β冠状病毒抗原的氨基酸序列包括直接串联的2个重复SEQIDNO：2氨基酸序列；
当β冠状病毒为2019新型冠状病毒时，β冠状病毒抗原的氨基酸序列包括选自以下氨基酸序列的任意一...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴连攀，严景华，高福，李燕，郑天依，徐坤，刘梅，安亚玲，施一，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11