一种重组β-半乳糖苷酶及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种重组β‑半乳糖苷酶及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域；本发明专利技术中构建了一种重组β—半乳糖苷酶β‑Gal‑LEH，通过将β‑Gal和ELP(VPGVG)

【技术实现步骤摘要】
一种重组β-半乳糖苷酶及其构建方法和应用
本专利技术属于生物工程
，具体包括一种重组β-半乳糖苷酶及其构建方法和应用。
技术介绍
乳糖是由D-葡萄糖和β-D-半乳糖单体组成的二糖，主要存在于牛奶等乳制品中，而β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，[EC3.2.1.23]）是水解乳糖所需的主要酶，它在人类的婴儿时期表达量较高，但是随着年龄的增长而呈现下降趋势。乳糖酶缺乏症的广泛存在是一个令人关注的问题，缺乏乳糖酶的人在食用牛奶或其他乳制品时通常会导致乳糖消化不良和吸收不良，从而引起腹痛、腹胀、发炎、肠胃气胀和腹泻等症状。为了使乳糖酶缺乏症患者能够食用含有乳糖的乳制品，需要在生产加工的过程中将乳制品中的乳糖水解。由于酶的作用温度和pH比较温和，不会对乳制品造成蛋白质变性或口味改变等严重的变化，还能保留乳制品的原始的营养价值，使其在水解乳制品中的乳糖中得到很好的应用。牛奶和乳清乳糖工业对高效β-半乳糖苷酶的广泛需求使其成为重要的研究课题。目前β-半乳糖苷酶存在稳定性较差，易发生杂菌污染，分离纯化较为困难，会增加生产初始成本，酶活也会有损失的问题。
技术实现思路
本专利技术旨在解决上述技术问题之一，为此，本专利技术提供了一种重组β-半乳糖苷酶及其构建方法和应用。本专利技术首先提供了一种重组β-半乳糖苷酶β-Gal-LEH，所述β-Gal-LEH的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，对应的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。上述重组β-半乳糖苷酶β-Gal-LEH通过如下方法构建，将β-Gal（Lactobacillussp.B164，登录号JF345715.1）与ELP(VPGVG)50通过接头Linker连接，并且在ELP(VPGVG)50的C段增加6x-His标签，得到重组β-半乳糖苷酶β-Gal-Linker-ELP-6x-His，将其简称为β-Gal-LEH。具体的，所述ELP(VPGVG)50为五肽序列Val-Pro-Gly-Val-Gly重复50次，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；所述接头Linker为连接肽(GGGGS)3，其核酸序列如SEQIDNO:4所示。本专利技术还提供了一种重组表达质粒pET28a（+）-β-Gal-LEH。本专利技术还提供了一种含有上述重组表达质粒的重组菌。本专利技术还提供了一种制备重组β-半乳糖苷酶的方法，所述方法为发酵培养上述重组菌，得到β-半乳糖苷酶。本专利技术还提供了所述重组β-半乳糖苷酶纯化的方法，所述纯化方法为采用浓度为1.5-2.0M的(NH4)2SO4进行可逆相变循环纯化。本专利技术所述重组β-半乳糖苷酶β-Gal-LEH在水解乳糖中的作用。本专利技术的优点：本专利技术中，在β-半乳糖苷酶中连接了ELP(VPGVG)50，使β-半乳糖苷酶具有敏感且可逆的相变特性，在低于其临界温度时呈随机线圈形状，并且高度溶解；而当高于其临界温度的温度时，β-半乳糖苷酶将变得不溶，形成较大的微米级聚合物并能够被观察到；直至温度重新低于临界温度时，此时β-半乳糖苷酶在溶液中重新溶解。通过可逆相变的多次循环可以实现β-半乳糖苷酶的纯化，得到更高的纯化倍数，并获得具有更高的活性和稳定性的β-半乳糖苷酶。本专利技术通过基因修饰技术构建了β-Gal-LEH重组β-半乳糖苷酶，在特定温度下，ELP表现出一种快速且热力学可逆的相变行为，ELP介导的纯化是一种廉价和高效的纯化形式，进而使重组β-半乳糖苷酶可以简单、快速、高效地自我纯化，这种快速而简单的纯化方式在效率上优于传统的镍柱亲和层析纯化方式，此外可以提高β-Gal酶热和不同温度储存条件下的稳定性。本专利技术中构建的重组β-Gal-LEH可以在更大的温度及pH范围内有效工作，有利于提高酶催化工艺的效率。本专利技术得到的融合蛋白更适合于生物催化工艺的应用，更能满足社会生产的要求，有广阔的市场前景。附图说明图1重组质粒pET28a（+）-β-Gal-LEH构建示意图。图2不同浓度（NH4)2SO4纯化的β-Gal-LEH的SDS-PAGE图。图3不同浓度（NH4)2SO4纯化后的β-Gal-LEH回收率与纯化倍数。图4实施例4中β-Gal-LEH和β-Gal-LH在不同温度（A）和pH（B）水解乳糖的效率。图5实施例5中β-Gal-LEH和β-Gal-LH的热稳定性（A）和储存稳定性（B）图。具体实施方式结合附图和以下实施例对本专利技术的技术方案作进一步的说明，但所述的实施例是为了更好的解释本专利技术，而不是对本专利技术的限制。实施例1：重组表达质粒的构建β-Gal基因来自于（Lactobacillussp.B164，登录号JF345715.1），生物公司全基因合成β-Gal核苷酸序列，且5’和3’分别带上SpeI和NheI，同时将全基因合成好的带有SpeI和NheI酶切位点的β-Gal核苷酸序列构建到pet28a（+）质粒上，命名为pet28a（+）-β-Gal。生物公司全基因合成Linker-ELP核苷酸序列，在linker的5’带有NheI酶切位点，ELP的3’带有HindI酶切位点，Linker和ELP之间有SacI酶切位点。然后将上述序列构建在PUC18质粒上，命名为PUC18-Linker-ELP质粒。使用NheI和HindI双酶切pet28a（+）-β-Gal和PUC18-Linker-ELP，所述双酶切体系为：NheI：1μl；HindI：1μL；10×Buffer：2μL；PUC18-Linker-ELP：5μL；无菌水：补齐至20μL；将上述体系加入离心管中并混合混匀，在37℃下酶切2-3h。然后按照常规胶回收试剂盒的方法回收Linker-ELP基因片段和PUC18-Linker-ELP。把胶回收得到的Linker-ELP基因片段和PUC18-Linker-ELP通过T4连接酶连接。所述连接体系为：10×T4Ligasebuffer：2μL；pet28a（+）-β-Gal：依回收浓度而定；Linker-ELP：依回收浓度而定；T4DNALigase（10U/μL）：1μL；无菌水：补齐至20μL；反应反应在在16℃的培养箱中进行，反应18小时左右，连接后得到重组质粒pET28a（+）-β-Gal-Linker-ELP-6x-His，命名pET28a（+）-β-Gal-LEH，核苷酸序列和限制酶位点如图1所示。实施例2：扩大培养表达β-Gal-LEH的大肠杆菌（1）将新鲜转化的重组大肠杆菌转移至补充有50μg/mL卡那霉素的固体LB培养基（琼脂粉15g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.4）中，并在37℃下培养过，然后将过夜培养后的单个菌落转移至5ml含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基（胰蛋白胨10g/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组β—半乳糖苷酶β-Gal-LEH，其特征在于，所述β-Gal-LEH的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组β—半乳糖苷酶β-Gal-LEH，其特征在于，所述β-Gal-LEH的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，对应的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。


2.一种重组β—半乳糖苷酶β-Gal-LEH的构建方法，其特征在于，所述构建方法为将β-Gal与ELP(VPGVG)50通过接头Linker连接，并且在ELP(VPGVG)50的C段增加6x-His标签，得到重组β—半乳糖苷酶β-Gal-Linker-ELP-6x-His，将其简称为β-Gal-LEH。


3.根据权利要求2所述的重组β—半乳糖苷酶β-Gal-LEH的构建方法，其特征在于，所述ELP(VPGVG)50为五肽序列Val-Pro-Gly-Val-...

【专利技术属性】
技术研发人员：周阳，施海锋，高力，顾杰，王莹莹，任真，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32