一种酶及其在合成普鲁兰多糖中的作用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种酶及其在合成普鲁兰多糖中的作用。AGS2不同结构域可以完成从胞内运输普鲁兰多糖前体物到胞外、抓取普鲁兰多糖前体物(α‑1,4‑葡聚糖)、切下麦芽三糖、麦芽三糖连接成普鲁兰多糖和把合成的普鲁兰多糖连接到细胞膜脂类载体上的所有功能。这是首次发现AGS2在普鲁兰多糖合成过程中的关键酶，也是首次发现具有这些特异结构域的多功能酶。该酶的发现有助于深入了解酵母菌合成普鲁兰多糖的具体途径和调控方式，对于通过代谢工程和分子编辑普鲁兰多糖合成及其物理化学性能具有重要的实际意义。从而解决了长期普鲁兰多糖合成途径、有关的关键酶和基因未解决的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种酶及其在合成普鲁兰多糖中的作用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种酶及其在合成普鲁兰多糖中的作用。
技术介绍
普鲁兰多糖主要是由Aureobasidiumspp.不同菌株产生的一种线性的胞外葡聚糖，在结构上是由α-(1→6)糖苷键将重复的麦芽三糖单元连接而成，其化学结构如图1所示；这种连接方式使普鲁兰多糖具有较好的结构柔性、水溶性、粘附性、成膜性和易降解性等特点。因此，它在食品、化妆品、生物医药等领域的用途广泛而备受关注。目前普鲁兰多糖是微生物产生的最重要的商品化胞外多糖之一，从上个世纪70年代开始日本的林原公司就已经开始大规模生产，并在全世界大量销售，在市场上Sigma公司销售价格是每公斤2000美元。中国国产的普鲁兰多糖价格为23万人民币/吨，进口价格为25万人民币/吨。尽管在上个世纪60年代，这种普鲁兰多糖结构(式1)就已经鉴定清楚了，但是这种化学结构在Aureobasidiumspp.细胞中是如何合成的，有关的酶和基因是什么，至今还不清楚。现在普遍认为α-磷酸葡萄糖变位酶催化来自糖酵解途径的6-磷酸-葡萄糖转化成1-磷酸-葡萄糖、在UDP-葡萄糖焦磷酸化酶催化下1-磷酸-葡萄糖和UTP起反应形成UDP-葡萄糖，形成的UDP-葡萄糖是合成普鲁兰多糖、海藻糖、糖原和细胞壁葡聚糖的共同前体物。1982年Catley和McDowell认为来自于UDP-葡萄糖的D-葡萄糖(G)通过磷酸酯键连接到膜的脂类分子(L-P-P)上形成L-P-P-G，来自UDP-葡萄糖的另一分子D-葡萄糖连续连接到L-P-P-G形成L-P-P-G-α-1,6-G和L-P-P-G-α-1,6-G-α-1,4-G，最后这个异潘糖基(isopanosyl)通过聚合作用形成普鲁兰多糖链。2008年，Duan等人认为在普鲁兰多糖的合成过程中，从葡萄糖转化为普鲁兰多糖需要3个关键酶：α-磷酸葡萄糖变位酶催化6-磷酸-葡萄糖转化成1-磷酸-葡萄糖、在UDP-葡萄糖焦磷酸化酶催化下1-磷酸-葡萄糖和UTP起反应形成UDP-葡萄糖和形成的UDP-葡萄糖在葡萄糖糖基转移酶作用下形成普鲁兰多糖。在此基础上，2015年Li等人提出了普鲁兰多糖可能的合成路径。首先，UDP-葡萄糖上的葡萄糖基在葡萄糖基转移酶的催化下，转移至细胞膜脂类(Lph)受体上，并通过磷脂键形成Lph-Glu；接着在第二个葡萄糖转移酶的催化下，UDP-葡萄糖上的葡萄糖基转移至Lph-葡萄糖分子上，并通过α-(1,6)糖苷键连接形成异麦芽糖基(Lph-Glu-α-(1,6)-Glu)；接着，在第3个葡萄糖转移酶的催化下重复上述UDP-葡萄糖的葡萄糖基转移过程，通过α-(1,4)糖苷键连接至异麦芽糖基上形成异潘糖基(Lph-Glu-α-(1,6)-Glu-α-(1,4)-Glu)；最后，在普鲁兰多糖合成酶的作用下，异潘糖基作为结构单元聚合形成普鲁兰多糖。但是上述假设的普鲁兰多糖合成途径没有任何遗传和生化证据。因此，关于普鲁兰的生物合成途径仍在不断的研究中。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种酶及其在合成普鲁兰多糖中的作用，该酶被命名为的α-葡聚糖合成酶2(α-glucansynthase2，简称AGS2)，其中一个结构域Big-5与普鲁兰多糖前体物α-1,4-葡聚糖特异结合，在α-葡聚糖合成酶2的另外一个结构域α-淀粉酶催化下从该普鲁兰多糖前体物上特异切下麦芽三糖，切下的麦芽三糖在α-葡聚糖合成酶2的糖苷转移酶1-糖原合成酶结构域催化下把多个麦芽三糖单位通过α-1,6-糖苷键连接成高分子量的普鲁兰多糖。本专利技术提供的酶(AGS2)包含：α-淀粉酶催化结构域、α-1,4-葡聚糖定位结构域、GT1-糖原合成酶结构域和胞外多糖-转糖基结构域。本专利技术提供的AGS2酶中至少还包含2个跨膜结构。本专利技术提供的AGS2酶中所述α-淀粉酶催化结构域的氨基酸序列包含Asp-X-Glu-Asp序列，所述X由任意2～5个氨基酸组成；作为优选，所述α-淀粉酶催化结构域包括SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；或包括与SEQIDNO:1具有至少90％同源性的氨基酸序列。一些具体实施例中，所述α-淀粉酶催化结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。所述α-淀粉酶催化结构域(SEQIDNO7所示氨基酸序列的第16到579位)，含有D-X-E-D催化氨基酸、是水解α-1,4-葡聚糖的α-1,4-糖苷键的特异氨基酸，它负责普鲁兰多糖前体物(α-1,4-葡聚糖)分子内α-1,4-糖苷键的水解释放出麦芽三糖亚单位。本专利技术提供的AGS2酶中所述α-1,4-葡聚糖定位结构域包含Leu-Gln-Ser序列；作为优选，所述α-1,4-葡聚糖定位结构域包括SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或包括与SEQIDNO:2具有至少90％同源性的氨基酸序列。一些具体实施例中，所述α-1,4-葡聚糖定位结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。AGS2酶中所述α-1,4-葡聚糖定位结构域是细菌免疫球蛋白类的结构域(SEQIDNO：7所示氨基酸序列的第724到828位)，简称Big-5结构域，该结构域负责把AGS2附着、结合和定位在普鲁兰多糖前体物(α-1,4-葡聚糖)分子链上。本专利技术提供的AGS2酶中所述GT1-糖原合成酶结构域包含Lys-Ile-Gly-Gly序列；作为优选，所述GT1-糖原合成酶结构域包括SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；或包括与SEQIDNO:3具有至少90％同源性的氨基酸序列。一些具体实施例中，所述GT1-糖原合成酶结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。保守的GT1-糖原合成酶结构域(SEQIDNO：7所示氨基酸序列的第1169到1625位)，(含有KIGG催化氨基酸，植物和藻类淀粉合成酶和糖原合成酶催化位点特异氨基酸)，催化释放的麦芽三糖通过α-1,6-糖苷键连接成普鲁兰多糖大分子。本专利技术提供的AGS2酶中所述胞外多糖-转糖基结构域包括SEQIDNO:4所示的氨基酸序列；或包括与SEQIDNO:4具有至少90％同源性的氨基酸序列。一些具体实施例中，所述胞外多糖-转糖基结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。保守的胞外多糖_转糖基结构域(SEQIDNO：7所示氨基酸序列的第1965到2351位)负责把合成的普鲁兰多糖大分子连接到细胞膜的脂类载体分子上。通过疏水性分析发现AGS2除了含有上述4个结构域外，还含有2个跨膜结构，其中之一的结构(在AGS2蛋白中间)跨膜一次，另外一个跨膜结构(在AGS2蛋白的羧基端)跨膜11次。2个所述跨膜结构分别为跨膜结构A和跨膜结构B：跨膜结构A在包括SEQIDNO:5所示的氨基酸序列的位置跨膜1次；跨膜结构B在包括SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的位置跨膜11次。本专利技术获得的AGS2酶中，Big-5结构域、保守的α-淀粉酶催化结构域、保守的GT1-糖原合成酶结构域和保守的胞外多糖_转糖基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶，其包含：α-淀粉酶催化结构域、α-1,4-葡聚糖定位结构域、GT1-糖原合成酶结构域和胞外多糖-转糖基结构域。/n

【技术特征摘要】
1.一种酶，其包含：α-淀粉酶催化结构域、α-1,4-葡聚糖定位结构域、GT1-糖原合成酶结构域和胞外多糖-转糖基结构域。


2.根据权利要求1所述的酶，其特征在于，其至少包含2个跨膜结构。


3.根据权利要求1或2所述的酶，其特征在于，所述α-淀粉酶催化结构域的氨基酸序列包含Asp-X-Glu-Asp序列，所述X由任意2～5个氨基酸组成；
作为优选，所述α-淀粉酶催化结构域包括SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；或包括与SEQIDNO:1具有至少90％同源性的氨基酸序列。


4.根据权利要求1或2所述的酶，其特征在于，所述α-1,4-葡聚糖定位结构域包含Leu-Gln-Ser序列；
作为优选，所述α-1,4-葡聚糖定位结构域包括SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或包括与SEQIDNO:2具有至少90％同源性的氨基酸序列。


5.根据权利要求1或2所述的酶，其特征在于，所述GT1-糖原合成酶结构域包含Lys-Ile-Gly-Gly序列；
作为优选，所述GT1-糖原合成酶结构域包括SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；或包括与SEQIDNO:3具有至少90％同源性的氨基酸序列。


6.根据权利要求1或2所述的酶，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：池振明，池哲，刘光磊，陈铁军，姜宏，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37