同时靶向间皮素和FAP的双靶点嵌合抗原受体及其用途制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种同时靶向间皮素和FAP的双靶点嵌合抗原受体及其用途。针对实体肿瘤中肿瘤细胞和成纤维细胞FAP表达上调这一现象，本发明专利技术提供一种同时靶向间皮素和FAP的双靶点嵌合抗原受体及其宿主细胞。本发明专利技术的双靶点嵌合抗原受体会竞争结合到FAP，将FAP的抑制信号转化为激活信号，增强T细胞杀伤活性，同时在其下游引入的4‑1BB能促进T细胞增殖、存活。本发明专利技术还提供了表达上述双靶点抗原受体的宿主细胞，以及它们在预防或治疗恶性肿瘤/实体瘤中的用途。

【技术实现步骤摘要】
同时靶向间皮素和FAP的双靶点嵌合抗原受体及其用途
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种同时靶向间皮素和FAP的双靶点嵌合抗原受体，本专利技术还涉及表达所述嵌合抗原受体的免疫反应细胞，以及所述嵌合抗原受体、免疫反应细胞的制备及其在诊断/治疗恶性肿瘤中的用途。
技术介绍
2013年，Science杂志将肿瘤免疫疗法列为年度十大科技进展之首。嵌合抗原受体修饰(chimericantigenreceptor,CAR)T细胞治疗是一项重要的肿瘤免疫疗法。利用抗原抗体scFv片段，链接T细胞胞内激活、增殖信号，形成嵌合型抗原受体(Chimericantigenreceptor，CAR)修饰的T细胞(CAR-T)，可使T细胞获得不依赖HLA(人类白细胞抗原)限制的抗原特异识别杀伤能力，其杀伤活性主要依赖CAR-T细胞表面的单链受体识别抗原，具有特异的杀伤活性。临床研究已经证实，这类CAR-T能够在体内增殖，存活并形成免疫记忆，在血液肿瘤临床试验中显示出高效的抗肿瘤活性。2017年CAR-T细胞产品Kymriah和Yescarta已被FDA批准用于血液肿瘤的临床治疗。然而，相比于在血液肿瘤治疗中取得的突破性进展，CAR-T细胞治疗在实体瘤中的应用进展缓慢。研究表明CAR-T细胞治疗实体瘤存在几个挑战：(1)实体瘤缺乏理想的靶抗原。多数实体瘤治疗靶点都是肿瘤相关抗原(Tumor-associatedantigens,TAA)。由于TAA表达在正常组织，靶向TAA存在潜在毒性。而且，实体瘤抗原在表达强度和分布方面存在明显的异质性。现有靶向单一抗原的CAR-T细胞无法清除所有肿瘤细胞，易导致肿瘤免疫逃逸。(2)实体瘤组织结构和蛋白表达异常，使CAR-T细胞难以通过血管等循环系统达到肿瘤部位。(3)在实体瘤中，局部抑制性免疫微环境会抑制抗肿瘤T细胞活性，如MDSC、Treg和肿瘤相关成纤维细胞等。多项临床试验表明，CAR-T细胞能够渗透至实体瘤内部并发挥靶向抗原的抗肿瘤活性，但是除极少数病例外，在患者体内的疗效是轻微和短暂的。因此，如何克服抑制性免疫微环境是CAR-T细胞治疗在实体瘤获得成功的关键。间皮素是一种通过磷脂酰肌醇区(GPI)锚定在细胞膜上的糖蛋白，在多种肿瘤组织中高表达，但也有少量间皮素表达于正常的胸膜、心包和腹膜间皮细胞。间皮素基因编码一种69kDa的前体蛋白，经加工后，形成一个40kDa的膜结合蛋白和一个31kDa的巨核细胞促进因子(MPF)，通常所说的间皮素指的是锚定在膜上的片段，根据其蛋白结构可以分为区域I、II、III三个区域。它一方面可以激活NFKB、MAPK和PI3K细胞内信号通路，促进细胞增殖和凋亡抵抗；另一方面与CA125/MUC16相互作用导致异常的细胞粘附，促进癌细胞转移。由于间皮素在正常组织中的分布有限而在多种恶性肿瘤(间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、胆管癌等)中过表达，因此是一个很有潜力的肿瘤特异性治疗靶点。目前，以间皮素为靶点的许多CAR-T细胞研究正在进行，国内国际上都已有多项临床试验开展，主要是针对胰腺癌，间皮瘤，肺癌和乳腺癌。但这些实体肿瘤都有一个特点，肿瘤间质比较丰富，其中含有大量的肿瘤相关成纤维细胞(Tumor-associatedfibroblast，TAF)。成纤维细胞活化蛋白(FibroblastActivationProtein，FAP，也称为seprase，是一种95kDaII型跨膜丝氨酸蛋白酶，在结构上与二肽基肽酶IV(DPPIV/CD26)相关。FAP在肿瘤组织中的反应性基质成纤维细胞和伤口愈合中表达。FAP也是一种内肽酶，可以降解明胶，I型和IV型胶原，纤连蛋白和层粘连蛋白以及几种肽激素(例如神经肽Y，脑利钠肽，物质P，肽YY和Incretins)。FAP的基质降解活性有助于肿瘤细胞的迁移和侵袭。此外，FAP可以通过限制抗肿瘤免疫力的发展来增强肿瘤细胞的生长。因此，以FAP作为治疗靶点，可以广泛应用于多种实体瘤的治疗；其次，将其作为激活信号，可以有效逆转肿瘤的抑制性免疫微环境，并且没有明显的毒副作用。针对实体瘤间质丰富和肿瘤相关成纤维细胞高表达FAP这一特征，我们前期设计构建了同时靶向间皮素和FAP的双靶点CAR病毒载体。本专利技术以间皮素及FAP双靶向CAR-T(dualCAR-T)为例，说明包含FAP靶点的双靶点嵌合抗原受体能消除肿瘤细胞，解除肿瘤内部间质细胞的免疫抑制，预防和治疗恶性肿瘤/实体瘤，并用于临床相关预防与治疗。
技术实现思路
针对实体瘤间质丰富和肿瘤相关成纤维细胞高表达FAP这一特征，本专利技术提供一种基因工程修饰的双靶点嵌合抗原受体及其宿主细胞。本专利技术要解决的第一个技术问题为：提供一种同时靶向间皮素和FAP的双靶点嵌合抗原受体，所述的双靶点嵌合抗原受体可结合两个不同的靶点，传递两种信号。本专利技术基因工程修饰的双靶点嵌合抗原受体，所述的双靶点嵌合抗原受体由识别间皮素的嵌合抗原受体1和识别成纤维细胞活化蛋白FAP的嵌合抗原受体2通过连接肽连接而成。其中，上述基因工程修饰的双靶点嵌合抗原受体中，所述的嵌合抗原受体2包括：FAP的单链抗体、铰链区、跨膜区和胞内结构域。进一步的，所述的FAP的单链抗体是指能够结合肿瘤细胞或免疫细胞表面FAP分子的FAP的单链抗体。进一步的，所述铰链区为人免疫球蛋白Fc段(IgG1Fc段)。进一步的，所述跨膜区为白细胞分化抗原8(CD8)跨膜区。进一步的，所述的胞内结构域为4-1BB胞内结构域。其中，所述的嵌合抗原受体2组成为：人FAP的scFv、IgG1Fc段、CD8跨膜区、4-1BB共刺激分子肽段。具体的，所述的嵌合抗原受体2的氨基酸序列为SEQIDNO：1所示。METDTLLLWVLLLWVPGSTGAQVQLKQSGAELVKPGASVKLSCKTSGYTFTENIIHWVKQRSGQGLEWIGWFHPGSGSIKYNEKKDKATLTADKSSSTVYMELSRLTSEDSAVYFCARHGGTGRGAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDILMTQSPASSVVSLSGQRATISCRASKSVSTSAYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPYTFGGGTKLEIKDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.同时靶向间皮素和FAP的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述的双靶点嵌合抗原受体由识别间皮素的嵌合抗原受体1和识别FAP的嵌合抗原受体2通过连接肽连接而成。/n

【技术特征摘要】
20191216 CN 20191129196981.同时靶向间皮素和FAP的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述的双靶点嵌合抗原受体由识别间皮素的嵌合抗原受体1和识别FAP的嵌合抗原受体2通过连接肽连接而成。


2.根据权利要求1所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述的嵌合抗原受体2包括：FAP的单链抗体、铰链区、跨膜区和胞内结构域。


3.根据权利要求1或2所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：满足下述至少一项；
所述的FAP的单链抗体是指能够结合肿瘤细胞或成纤维细胞表面FAP分子的FAP的单链抗体；
所述铰链区为人IgG1Fc段；
所述跨膜区为CD8跨膜区；
所述的胞内结构域为4-1BB胞内结构域。


4.根据权利要求1-3任一项所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述的嵌合抗原受体2组成为：人体的FAP的scFv、人IgG1Fc段、CD8跨膜区、4-1BB共刺激分子肽段。


5.根据权利要求1-4任一项所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述的嵌合抗原受体2的氨基酸序列为SEQIDNO：1所示。


6.根据权利要求1-5任一项所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述的嵌合抗原受体1包括：能够结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的单链抗体、铰链区、跨膜区和胞内免疫受体酪氨酸活化基序。


7.根据权利要求1-6任一项所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原为EGFR、EpCAM、间皮素、IL-13Rα2、ERBB2、ERBB3、ERBB4、VEGFR1、VEGFR2、GD2、FR、PSMA、gp100、MUC1、MUC16、CA9、CD171、CD125、CD15-3、CD19-9、NY-ESO-1、MART-1、MAGE4、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CEA、CD38、CD138、CD123、EphA2、IGFR中的至少一种。


8.根据权利要求1-7任一项所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述的能够结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的单链抗体是指能够结合EGFR家族蛋白，包括EGFR、HER2、ERBB3、ERBB4或EGFRvIII、EpCAM、mesothelin、IL-13Rα2、VEGFR1、VEGFR2、GD2、FR、PSMA、gp100、MUC1、MUC16、CA9、CD171、CD125...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭福春，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川;51