一种利福昔明半抗原、人工抗原及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种利福昔明半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。本发明专利技术所提供的利福昔明人工抗原为将式I所示的利福昔明半抗原与载体蛋白偶联所得的抗原。本发明专利技术所提供利福昔明人工抗原合成方法简单，纯度高和产率高，对于利福昔明抗体的制备，以及利福昔明药物残留检测具有重大价值。

【技术实现步骤摘要】
一种利福昔明半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
本专利技术属于药物残留快速检测领域，涉及一种利福昔明人工抗原及其制备方法与应用。
技术介绍
利福昔明属于利福霉素类抗菌药物，是利福霉素的半合成衍生物，主要通过与细菌依赖DNA的RNA聚合酶中β-亚单位不可逆结合来抑制细菌RNA的合成，从而达到杀菌的目的。其对革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、棒状杆菌等）和革兰氏阴性菌（如大肠杆菌等）均有良好的抗菌活性。利福昔明在兽医上主要作为奶牛干乳期乳房注入剂，用于防治奶牛干乳期乳腺炎，由于效果良好而被广泛应用，欧盟规定利福昔明在牛奶中的残留标示物为原型药物，最高残留限量（MRL）为60μg/kg，我国兽药残留限量中尚无关于利福昔明残留限量的规定。目前对于利福昔明残留检测方法的有液相色谱-质谱（LC-MS）和质谱法（MS），虽然这些方法特异性强、灵敏度高，但是操作繁琐、仪器昂贵，不适用于大批量样品的筛选检测。免疫化学分析鉴于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足，在利福昔明的残留检测中起着越来越重要的作用。影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成是产生特异性抗体和建立小分子兽药残留快速检测技术的最基础、最关键的步骤。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利福昔明人工抗原及其制备方法与应用。本专利技术所提供的利福昔明人工抗原是在利福昔明半抗原的基础上构建所得的抗原。所述利福昔明半抗原属于本专利技术的保护范围，其结构如式I所示。式I本专利技术所提供的制备所述利福昔明半抗原的方法，具体可包括如下步骤：1、利福霉素S溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，加入N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）反应，反应液经沉淀、过滤、干燥获得670mg中间体1。所述利福霉素S、二甲基甲酰胺（DMF）、N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）的配比为1000mg：6ml：300mg。2、中间体1溶解于甲醇中，加入三乙胺、2-氨基异烟酸反应，反应液经旋干、层析纯化、旋干获得386mg产物。所述中间体1、甲醇、三乙胺、2-氨基异烟酸的配比为500mg：5ml：2ml：100mg，所述层析展开剂为二氯甲烷和甲醇，二氯甲烷、甲醇的配比为15：1。在利福昔明半抗原的基础上构建所得的利福昔明抗原也属于本专利技术的保护范围。所述利福昔明抗原，为将所述利福昔明半抗原（式I）与载体蛋白偶联所得的抗原。在本专利技术的一个实施例中，所述载体蛋白具体为牛血清白蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA）。所述利福昔明抗原的制备方法也属于本专利技术的保护范围。所述利福昔明抗原的制备方法，具体可包括如下步骤：将所述利福昔明半抗原（式I）与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述利福昔明抗原。在本专利技术中，所述利福昔明抗原具体是按照包括如下步骤的方法制备获得的：（1）将所述利福昔明半抗原（式I）溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），20-25℃磁力搅拌反应2-3h，得到溶液I；其中，所述利福昔明半抗原（式I）、所述二甲基甲酰胺（DMF）、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、所述N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的配比为30.4mg：1.5ml：25.75mg：15.46mg。（2）将所述载体蛋白置于0.1M碳酸氢钠缓冲液中，200rpm搅拌10min，充分溶解，得到溶液II；所述载体蛋白与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为33.6-50mg：3.5ml；其中，若所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA），则所述牛血清白蛋白（BSA）与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为50mg：3.5ml；若所述载体蛋白为卵清蛋白（OVA），则所述卵清蛋白（OVA）与所述0.1M碳酸缓冲液的配比为33.6mg：3.5ml；（3）将所述溶液I和所述溶液II混合，具体为在0-4℃条件下，1000rpm搅拌下，将溶液I逐滴加入到所述溶液II中，500rpm搅拌反应24h，得到溶液III；（4）用磷酸盐缓冲液（0.01MPBS，pH7.2），于4℃对所述溶液III搅拌透析3天，得到所述利福昔明抗原。所述利福昔明半抗原（式I）或所述利福昔明抗原在定性或定量检测利福昔明中的应用也属于本专利技术的保护范围。利用所述利福昔明抗原制备的抗体也属于本专利技术的保护范围。所述抗体可为多克隆抗体、单克隆抗体或抗血清。本专利技术所提供的利福昔明半抗原，以及所述利福昔明抗原，合成方法简单、纯度高、产率高，对于利福昔明抗体的制备，以及利福昔明药物残留检测具有重大价值。附图说明图1为利福昔明半抗原质谱图。图2为利福昔明的标准曲线。图3为ELISA法检测两种样本（牛肉、牛奶）与LC-MS检测结果一致性。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、利福昔明半抗原的制备及鉴定1、利福昔明半抗原的制备将50ml圆底烧瓶冲洗干净，用乙醇吹干，将其固定在搅拌器上，加入搅拌子。称取1g利福霉素S，用6mlDMF溶解，搅拌，全部溶解后留样，此时溶液为紫色，称取300mgNBS，加入其中，搅拌，通过TLC发现反应完全时，处理，加入到冰水中，析出沉淀，过滤得到固体，干燥得到670mg中间体1。称取500mg中间体1，用5ml甲醇溶解，搅拌，加入2ml三乙胺，再加入100mg2-氨基异烟酸，搅拌，点板监测，当原料没有变化时，处理反应，旋干反应液，残余物柱层析纯化，展开剂比例：（二氯甲烷：甲醇=15:1）收集所需要的溶液，旋干得到386mg产物。反应方程式如下：2、利福昔明半抗原的结构鉴定对所得386mg产物进行质谱检测（图1），结果显示其化学结构式如式I所示（MW=815.87），即为利福昔明半抗原。式I实施例2、利福昔明人工抗原的制备1、免疫原的合成（1）将30.4mg利福昔明半抗原用1.5mlDMF溶解，200rpm搅拌10min，加入25.75mgEDC、15.46mgNHS溶解，室温搅拌（500rpm）活化2-3h。（2）称取50mgBSA溶于3.5ml0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入（1ml/min），500rpm搅拌反应24h。（3）将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋（10cm），1L0.01MPBS（1×，pH7.2）4℃搅拌（100rpm）透析3d，每天换液3次（早中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种化合物，其结构如式I所示：/n

【技术特征摘要】
1.一种化合物，其结构如式I所示：



式I。


2.制备权利要求1所述化合物的方法，包括步骤为：
利福霉素S溶解于二甲基甲酰胺中，加入N-溴代琥珀酰亚胺反应，反应液经沉淀、过滤、干燥获得670mg中间体1，所述利福霉素S、二甲基甲酰胺、N-溴代琥珀酰亚胺的配比为1000mg：6ml：300mg；
中间体1溶解于甲醇中，加入三乙胺、2-氨基异烟酸反应，反应液经旋干、层析纯化、旋干获得386mg产物，所述中间体1、甲醇、三乙胺、2-氨基异烟酸的配比为500mg：5ml：2ml：100mg，所述层析展开剂为二氯甲烷和甲醇，二氯甲烷、甲醇的配比为15：1。


3.利福昔明抗原，为将权利要求1所述化合物与载体蛋白偶联所得的抗原。


4.根据权利要求3所述的利福昔明抗原，其特征在于：所述载体蛋白可以是牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白或兔血清蛋白。


5.根据权利要求3或4所述的利福昔明抗原的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述化合物与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述利福昔明抗原。


6.根据权利要求5所述的利福昔明抗原的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
（1）将所述化合物溶解于二甲基甲酰胺中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，20-25℃磁力搅拌反应2-3h，得到溶液I；
其中，所述化合物、所述二甲基甲酰胺、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、所述N-羟基琥珀酰亚胺的配比为30.4mg：1...

【专利技术属性】
技术研发人员：马立才，聂靖东，丁亚芳，邢维维，刘薇，李蓉蓉，
申请(专利权)人：北京维德维康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11