鸡沙门菌SifA蛋白在制备用于检测鸡沙门菌抗体的ELISA抗体检测试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鸡沙门菌SifA蛋白在制备用于检测鸡沙门菌抗体的ELISA抗体检测试剂盒中的应用，本发明专利技术表达并纯化了鸡沙门菌SifA蛋白作为ELISA的包被抗原，对试剂盒工作程序进行了优化，用SPF鸡制备了鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、波氏杆菌和副鸡禽杆菌的标准阳性血清，用健康SPF鸡制备了标准阴性血清，并用该试剂盒检测所制备的阳性血清和阴性血清，证明其具有良好的特异性。本发明专利技术的试剂盒检测了大批量临床血清，并与临床上检测沙门菌常用的玻板凝集试验进行了比较，证明了该试剂盒的实用性。该试剂盒可用于鸡沙门菌感染后抗体的检测，为鸡沙门菌病提供一种快速准确的抗体检测方法。

【技术实现步骤摘要】
鸡沙门菌SifA蛋白在制备用于检测鸡沙门菌抗体的ELISA抗体检测试剂盒中的应用
本专利技术涉及生物技术和动物细菌学检测
，具体涉及一种鸡沙门菌SifA蛋白在制备用于检测鸡沙门菌抗体的ELISA抗体检测试剂盒中的应用。
技术介绍
沙门菌是世界卫生组织法定报告的人兽共患病原菌之一，在我国被列为二类传染病，给畜牧业生产和人类健康造成了重大威胁(罗薇，黄翠颖，王凡，刘博闻，潘志明，耿士忠，焦新安.某规模化种鸡场沙门菌流行现状调查、耐药性分析及分子分型[C].中国畜牧兽医学会.中国畜牧兽医学会2018年学术年会禽病学分会第十九次学术研讨会论文集.中国畜牧兽医学会:中国畜牧兽医学会，2018:114.)。沙门菌是食源性致病菌之一，沙门菌可通过被污染的蛋类或肉制品等导致人患上沙门菌病，出现腹泻、呕吐、发热、败血症等症状，严重危害食品安全和公共卫生(李卓阳，郭荣显，孟闯，张云增，耿士忠，焦新安，潘志明.肠炎沙门菌与鸡蛋：污染机制、危害分析及生物防控[J].中国家禽，2018，40(17):40–44)。沙门菌对养鸡业所造成的危害十分突出，可造成严重的经济损失，成年鸡感染可能会出现腹泻、食欲不振、产蛋率下降、孵化率下降等非典型的症状，有的鸡也可呈隐性感染状态不被发现，既可水平传播也可垂直传播，在感染过程中幸存下来的鸡可能成为沙门菌的传染源(ErikssonH,R,ErnholmL,MelinL,JanssonDS.Diagnostics,epidemiologicalobservationsandgenomicsubtypinginanoutbreakofpullorumdiseaseinnon-commercialchickens[J].VetMicrobiol,2018,217:47–52)。沙门菌在鸡群中高水平的感染和持续存在，需要建立一种高效、特异、灵敏、稳定的检测方法，以便能够及时检测到该病的发生，对其进行防治。在沙门菌病的检测方法中，基于病原的检测方法需要考虑沙门菌的间歇性排毒，样品的采集费时费力并且样品在采集或运输过程中容易污染(王杰，陈颖钰，彭清洁，郭爱珍.沙门菌检测方法研究进展[J].动物医学进展,2016,37:94–98)。而基于血清抗体的检测方法不用考虑感染动物是否处于排毒期，采集的全血或血清不容易污染，且检测方法更方便。鸡沙门菌血清抗体检测被OIE推荐使用的方法是玻板凝集试验，并在欧洲等国家的鸡白痢净化中起到了重要作用(世界动物卫生组织.陆生动物诊断试验及疫苗手册[M].北京：中国农业出版社，2012:514–529)。目前，玻板凝集试验为我国养鸡场净化鸡白痢沙门菌常用的检测方法，其抗原系用标准型和变异型鸡白痢、鸡伤寒沙门菌，经适宜培养基培养，收获菌体，经灭活，乙醇处理后加入结晶紫和甘油等制成(参照北京中海生物科技有限公司，鸡白痢鸡伤寒多价染色平板凝集试验抗原说明书)。由于玻板凝集试验的抗原为多价抗原，所以特异性并不是很强。该方法虽然操作简单，成本低，不需要专业人员操作，可现场操作，但是敏感性和特异性低，主观性强并且不同生产厂家或者同一生产厂家不同批次检测结果有差异(顾小雪，刘洋，霍斯琪，刘玉良，韩雪，张倩，翟新验，王传彬.鸡白痢/禽伤寒沙门菌抗体检测试剂的比较与评估.中国兽医学报，2018，38:108–112)。与玻板凝集试验相比，ELISA检测敏感性高，特异性强，可以定量检测，样品不需要做特别的处理，短时间内可以检测大量样品，省时省力并且费用较低，可用于对疾病的监测和诊断(KuhnKG,FalkenhorstG,CeperTH,DalbyT,EthelbergS,K,KrogfeltKA.Detectingnon-typhoidSalmonellainhumansbyELISAs:aliteraturereview[J].JMedMicrobiol,2012,61:1–7)。因此，迫切需要建立一种鸡沙门菌抗体的敏感特异的ELISA检测方法，以达到更敏感、特异、快速、高效，批量检测的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种鸡沙门菌SifA蛋白在制备用于检测鸡沙门菌抗体的ELISA抗体检测试剂盒中的应用，本专利技术核心是以纯化的重组SifA蛋白作为ELISA包被的抗原，建立鸡沙门菌SifA-ELISA抗体检测试剂盒；SifA蛋白经过同源性比对，其在沙门菌中高度保守，而与其它病原菌同源性很低。经过SPF鸡制备鸡源标准阳性血清和标准阴性血清进行检测，也证明鸡沙门菌SifA-ELISA抗体检测试剂盒特异性良好，在临床血清的检测当中也有很好的检测效果。该试剂盒在鸡沙门菌的血清学诊断、血清流行病学调查中将提供重要的参考意义。为实现上述目的，本专利技术设计了一种鸡沙门菌SifA蛋白在制备用于检测鸡沙门菌抗体的ELISA抗体检测试剂盒中应用，其中，鸡沙门菌SifA蛋白的氨基酸序列组成如SEQIDNo.2所示。本专利技术还提供了一种用于检测鸡沙门菌抗体的鸡沙门菌SifA-ELISA抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括鸡沙门菌SifA蛋白作为包被抗原的酶标板、由沙门菌感染SPF鸡所制备的阳性对照血清、健康SPF鸡阴性血清、兔抗鸡酶标二抗、血清稀释液、10倍浓缩洗涤液、显色液A、显色液B和终止液。进一步地，所述酶标板的制作方法如下：用pH9.6的0.5M碳酸盐缓冲液将鸡沙门菌SifA蛋白稀释为0.25μg/mL，每个酶标孔加入100μL，4℃包被12h，用PBS缓冲液制备成含质量分数为5％的脱脂牛奶作为封闭液，37℃温箱孵育2h。再进一步地，所述鸡沙门菌SifA蛋白对应的鸡沙门菌sifA基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。再进一步地，所述鸡沙门菌SifA蛋白的制备方法，包括以下步骤：1)根据上述鸡沙门菌sifA基因的核苷酸序列合成得到鸡沙门菌sifA基因，并设计带有酶切位点的引物：P1，CCGGAATT(EcoRI)CCCGATTACTATAGGGAATGG，P2，CCGCTCGAG(XhoI)TTAGCCGCTTTGTTGTTCT；2)将PCR产物与pET-28a载体酶切连接，构建得到重组质粒pET-28a-sifA，将组质粒pET-28a-sifA转化入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，用LB液体培养基扩大培养，并加入IPTG诱导蛋白的表达；3)将诱导后的大肠杆菌离心取沉淀，加缓冲液重悬，用低温超高压细胞破碎仪破碎重悬的菌体，再经离心取上清液，对上清液中的SifA蛋白进行纯化，得到重组蛋白SifA，即为鸡沙门菌SifA蛋白。再进一步地，所述阳性对照血清为SPF鸡感染沙门菌(鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌)后20d，翼下静脉采集血液所制备的血清；所述健康SPF鸡阴性血清为同等条件下健康SPF鸡的血清；所述血清稀释液为：PBS(pH7.4)缓冲液中含质量分数为0.2％的牛血清白蛋白和体积分数为0.05％的Tween-20；所述10倍浓缩洗涤液：浓缩10倍的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡沙门菌SifA蛋白在制备用于检测鸡沙门菌抗体的ELISA抗体检测试剂盒中的应用，其中，鸡沙门菌SifA蛋白的氨基酸序列组成如SEQ ID No.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种鸡沙门菌SifA蛋白在制备用于检测鸡沙门菌抗体的ELISA抗体检测试剂盒中的应用，其中，鸡沙门菌SifA蛋白的氨基酸序列组成如SEQIDNo.2所示。


2.一种用于检测鸡沙门菌抗体的鸡沙门菌SifA-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括鸡沙门菌SifA蛋白作为包被抗原的酶标板、由沙门菌感染SPF鸡所制备的阳性对照血清、健康SPF鸡阴性血清、兔抗鸡酶标二抗、血清稀释液、10倍浓缩洗涤液、显色液A、显色液B和终止液。


3.根据权利要求2所述用于检测鸡沙门菌抗体的鸡沙门菌SifA-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述酶标板的制作方法如下：
用pH9.6的0.5M碳酸盐缓冲液将鸡沙门菌SifA蛋白稀释为0.25μg/mL，每个酶标孔加入100μL，4℃包被12h，用PBS缓冲液制备成质量分数为5％的脱脂牛奶作为封闭液，37℃温箱孵育2h。


4.根据权利要求2或3所述用于检测鸡沙门菌抗体的鸡沙门菌SifA-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述鸡沙门菌SifA蛋白对应的sifA基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。


5.根据权利要求4所述用于检测鸡沙门菌抗体的鸡沙门菌SifA-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述鸡沙门菌SifA蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1)根据上述鸡沙门菌sifA基因的核苷酸序列合成得到鸡沙门菌sifA基因，并设计带有酶切位点的引物：
P1：CCGGAATTCCCGATTACTATAGGGAATGG，
P2：CCGCTCGAGTTAGCCGCTTTGTTGTTCT；
2)将PCR产物与pET-28a载体酶切连接，构建得到重组质粒pET-28a-sifA，将重组质粒pET-28a-sifA转化入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，用LB液体培养基扩大培养，并加入IPTG诱导蛋白的表达；
3)将诱导后的大肠杆菌离心取沉淀，加缓冲液重悬，用低温超高压细胞破碎仪破碎重悬的菌体，再经离心取上清液，对上清液中的SifA蛋白进行纯化，得到重组蛋白SifA，即为鸡沙门菌SifA蛋白。


6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡旭旺，高东阳，于江旭，田艳红，焦宇洲，王迪轩，徐晓娟，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42