一种(R)-3-羟基丁酸的制备方法技术

本申请公开了一种(R)‑3‑羟基丁酸的制备方法。以聚‑β‑羟丁酸为底物，按质量比2～2.2％的比例加入活化的菌，得到混合酶液，将上述混合酶液接入扩增培养基中，静置培养1h，替换60％体积的扩增培养基，在溶氧3.0～3.2mg/L、温度32～35℃的条件下，培养20～24h，每3h替换60％体积的扩增培养基；扩增后的混合酶液，按1:2的体积比加入发酵培养基，在溶氧4.5～4.8mg/L、温度28～32℃的条件下进行好氧发酵，发酵过程中补入O

【技术实现步骤摘要】
一种(R)-3-羟基丁酸的制备方法
本申请涉及生物合成
，具体而言，涉及一种(R)-3-羟基丁酸的制备方法。
技术介绍
3-羟基丁酸(3-HB)是哺乳动物肝脏内长链脂肪酸的主要代谢产物，是酮体家族的重要一员，存在于血浆和外周组织中。当机体处于长时间饥饿状态或因过度运动导致葡萄糖功能不足时，3-羟基丁酸可直接为大脑提供能量。此外，3-羟基丁酸还被认为可用来治疗多种疾病，例如神经细胞保护、减少辅酶Q的氧化损伤、癌症(如脑癌)、葡萄糖代谢紊乱等。体内3-羟基丁酸以(R)-3-羟基丁酸的光学异构体存在，最近的研究表明，(R)-3-羟基丁酸的效用远优于(S)-3-羟基丁酸。目前，(R)-3-羟基丁酸主要由化学法合成，效率低、成本高、三废高，部分工艺还要用到金属和高压氢化等条件。这些因素极大地限制的了(R)-3-羟基丁酸的使用。因此，寻找绿色、安全、简易、高效的合成方法显得十分迫切。。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种发酵法制备(R)3-羟基丁酸的方法，本专利技术提供了一种(R)-3-羟基丁酸的制备方法，按照如下步骤进行：以聚-β-羟丁酸为底物，按质量比2～2.2％的比例加入活化的菌，得到混合酶液，将上述混合酶液接入扩增培养基中，静置培养1h，替换60％体积的扩增培养基，在溶氧3.0～3.2mg/L、温度32～35℃的条件下，培养20～24h，每3h替换60％体积的扩增培养基；扩增后的混合酶液，按1:2的体积比加入发酵培养基，在溶氧4.5～4.8mg/L、温度28～32℃的条件下进行好氧发酵，发酵过程中补入O2和CO2，培养40～72h，即得。具体的，所述的活化的菌为枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆。进一步的，本专利技术所述的活化的菌优选为谷氨酸棒杆菌。该菌种具有将丙酮酸和辅酶A转化为乙酰-CoA，将乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA，将乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸，并将乙酰乙酸转化为(R)-3-羟基丁酸的能力。具体的，所述的扩增培养基为：酵母粉4～6g/L，蛋白胨8～10g/L，氯化钠8～10g/L，微量元素溶液1～1.2ml/L，pH为7.2～7.3。所述的微量元素溶液含有：硫酸锰1.4g/L、乙二胺四乙酸二钠1.0g/L、硼酸0.8g/L、硫酸铜0.2g/L、硫酸锌0.2g/L、硅酸钠0.2g/L、氯化钴0.1g/L、钼酸钠0.05g/L、硫酸镍0.05g/L。具体的，所述的发酵培养基为：4～4.5g/L亚磷酸二氢钾、3.5～3.6g/L硫酸铵、1.2～1.3g/L硫酸镁、2～2.2g/L氯化铵、1～1.2g/L柠檬酸、0.090～0.11g/L氨苄青霉素、40～45g/L葡萄糖和1～1.2ml/L微量元素溶液，pH为6.9～7.0。所述的微量元素溶液含有：三氯化铬0.8g/L、硫酸铁0.5g/L、氯化钴0.3g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸锌0.1g/L、硫酸铜0.06g/L、硫酸锰0.03g/L。具体的，所述的(R)-3-羟基丁酸的制备方法的后处理步骤为：将所得发酵液，以2000～3000rpm离心10min，弃去沉淀，上清液经0.45μm的过滤器过滤后，再与活性炭混合搅拌20min，加入5kD超滤管，3200rpm离心60min，取滤液，通过阳离子交换树脂，交换后，收集油状物。具体的，在好氧发酵过程中，根据情况补入O2和CO2，两者的体积比例为1:6～8，优选1:6。。有益效果：本专利技术提供了一种新颖的(R)-3-羟基丁酸的制备方法。本专利技术所述的制备方法，与化学合成法相比，效率高、不产生三废，是一种绿色、安全、简易的制备方法。并且，可以得到纯度较高的(R)-3-羟基丁酸。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。实施例1以聚-β-羟丁酸为底物，按质量比2％的比例加入活化的谷氨酸棒杆菌，得到混合酶液，将上述混合酶液接入扩增培养基中，静置培养1h，替换60％体积的扩增培养基，在溶氧3.0mg/L、温度32℃的条件下，培养20h，每3h替换60％体积的扩增培养基。所述的扩增培养基为：酵母粉4g/L，蛋白胨8g/L，氯化钠8g/L，微量元素溶液1ml/L，pH为7.2。(其中，所述的微量元素溶液含有如下元素：硫酸锰1.4g/L、乙二胺四乙酸二钠1.0g/L、硼酸0.8g/L、硫酸铜0.2g/L、硫酸锌0.2g/L、硅酸钠0.2g/L、氯化钴0.1g/L、钼酸钠0.05g/L、硫酸镍0.05g/L)。扩增后的混合酶液，按1:2的体积比加入发酵培养基，所述的发酵培养基为：4g/L亚磷酸二氢钾、3.5g/L硫酸铵、1.2g/L硫酸镁、2g/L氯化铵、1g/L柠檬酸、0.09g/L氨苄青霉素、40g/L葡萄糖和1ml/L微量元素，pH为6.9。(其中，所述的微量元素溶液含有：三氯化铬0.8g/L、硫酸铁0.5g/L、氯化钴0.3g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸锌0.1g/L、硫酸铜0.06g/L、硫酸锰0.03g/L)，在溶氧4.5mg/L、温度28℃的条件下进行好氧发酵，发酵过程中补入O2和CO2(O2和CO2体积比1:6)，培养40h，即得。实施例2以聚-β-羟丁酸为底物，按质量比2.2％的比例加入活化的谷氨酸棒杆菌，得到混合酶液，将上述混合酶液接入扩增培养基中，静置培养1h，替换60％体积的扩增培养基，在溶氧3.2mg/L、温度35℃的条件下，培养24h，每3h替换60％体积的扩增培养基，所述的扩增培养基为：酵母粉6g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，微量元素溶液1.2ml/L，pH为7.3。(其中，所述的微量元素溶液含有如下元素：硫酸锰1.4g/L、乙二胺四乙酸二钠1.0g/L、硼酸0.8g/L、硫酸铜0.2g/L、硫酸锌0.2g/L、硅酸钠0.2g/L、氯化钴0.1g/L、钼酸钠0.05g/L、硫酸镍0.05g/L)。扩增后的混合酶液，按1:2的体积比加入发酵培养基，所述的发酵培养基为：4.5g/L亚磷酸二氢钾、3.6g/L硫酸铵、1.3g/L硫酸镁、2.2g/L氯化铵、1.2g/L柠檬酸、0.11g/L氨苄青霉素、45g/L葡萄糖和1.2ml/L微量元素，pH为7.0。(其中，所述的微量元素溶液含有：三氯化铬0.8g/L、硫酸铁0.5g/L、氯化钴0.3g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸锌0.1g/L、硫酸铜0.06g/L、硫酸锰0.03g/L)，在溶氧4.8mg/L、温度32℃的条件下进行好氧发酵，发酵过程中补入O2和CO2(O2和CO2体积比1:6)，培养72h，即得。实施例3以聚-β-羟丁酸为底物，按质量比2.1％的比例加入活化的谷氨酸棒杆菌，得到混合酶液，将上述混合酶液接入扩增培养基中，静置培养1h，替换60％体积的扩增培养基，在溶氧3.1m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种(R)-3-羟基丁酸的制备方法，其特征在于按照如下步骤进行：/n以聚-β-羟丁酸为底物，按质量比2～2.2％的比例加入活化的菌，得到混合酶液，将上述混合酶液接入扩增培养基中，静置培养1h，替换60％体积的扩增培养基，在溶氧3.0～3.2mg/L、温度32～35℃的条件下，培养20～24h，每3h替换60％体积的扩增培养基；扩增后的混合酶液，按1:2的体积比加入发酵培养基，在溶氧4.5～4.8mg/L、温度28～32℃的条件下进行好氧发酵，发酵过程中补入O

【技术特征摘要】
1.一种(R)-3-羟基丁酸的制备方法，其特征在于按照如下步骤进行：
以聚-β-羟丁酸为底物，按质量比2～2.2％的比例加入活化的菌，得到混合酶液，将上述混合酶液接入扩增培养基中，静置培养1h，替换60％体积的扩增培养基，在溶氧3.0～3.2mg/L、温度32～35℃的条件下，培养20～24h，每3h替换60％体积的扩增培养基；扩增后的混合酶液，按1:2的体积比加入发酵培养基，在溶氧4.5～4.8mg/L、温度28～32℃的条件下进行好氧发酵，发酵过程中补入O2和CO2，培养40～72h，即得。


2.根据权利要求1所述的(R)-3-羟基丁酸的制备方法，其特征在于所述的活化的菌为枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆。


3.根据权利要求2所述的(R)-3-羟基丁酸的制备方法，其特征在于所述的活化的菌优选为谷氨酸棒杆菌。


4.根据权利要求1所述的(R)-3-羟基丁酸的制备方法，其特征在于所述的扩增培养基为：酵母粉4～6g/L，蛋白胨8～10g/L，氯化钠8～10g/L，微量元素溶液1～1.2ml/L，pH为7.2～7.3。


5.根据权利要求4所述的(R)-3-羟基丁酸的制备方法，其特征在于扩增培养基中，所述的微量元素溶液含有：硫酸锰1.4g/L、乙二胺四乙酸二钠1.0g/L、硼酸0.8g/L、硫酸铜0....

【专利技术属性】
技术研发人员：廖琪林，
申请(专利权)人：南京纽邦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32