一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备L-草铵膦的方法技术

本发明专利技术公开了一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备L‑草铵膦的方法，以D,L‑草铵膦为原料，经酶催化体系催化获得L‑草铵膦，所述酶催化体系包括用于将D,L‑草铵膦中的D‑草铵膦催化为2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的D‑氨基酸氧化酶突变体、以及用于将2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸催化还原为L‑草铵膦的转氨酶，所述D‑氨基酸氧化酶突变体由野生菌Rhodotorula taiwanensis中的D‑氨基酸氧化酶突变所得，突变位点选自以下四种中的一种：(1)M213S；(2)M213S‑N54V‑F58E；(3)M213S‑N54V‑F58E‑D207A；(4)M213S‑N54V‑F58E‑D207A‑S60T。本发明专利技术D‑氨基酸氧化酶突变体具有更好的催化效率，以外消旋D,L‑草铵膦为底物进行催化反应时，转化率远高于野生型酶，PPO产率也大幅提升。

A method of asymmetric preparation of l-glyphosate by oxidation-reduction of biological multi enzyme coupling

【技术实现步骤摘要】
一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备L-草铵膦的方法
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备L-草铵膦的方法。
技术介绍
草铵膦，又名草丁膦，英文名为Phosphinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(几经合并后现归属拜耳公司)开发生产。草铵膦属膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成酶抑制剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂。众所周知，灭生性除草剂市场巨大。目前，世界三大除草剂分别为百草枯，草甘膦，草铵膦。在市场使用方面，草甘膦独占鳌头，但是由于其长期使用，使得大量杂草产生抗性，而草甘膦也趋于失效；百草枯由于其剧毒性，已被列入《鹿特丹公约》，全球越来越多国家禁用或限用，中国农业部已发布公告说明，百草枯在2014年7月1日停止生产，2016年7月1日禁止使用；而目前草铵膦产量虽小，却具有优异的除草性能和较小的药害副作用，因此，在未来一段时间内拥有巨大的市场潜力。草铵膦由两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有除草活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。手性纯L-草铵膦的主要制备方法主要由三种：手性拆分法，化学合成法和生物催化法。手性拆分法是通过对外消旋D,L-草铵膦或其衍生物进行手性拆分，实现D型和L型异构体的分离，从而得到光学纯的L-草铵膦。此工艺主要存在以下缺点：需要使用昂贵手性拆分试剂、理论收率只能达到50％、单次拆分率低、工艺比较复杂。化学合成法是从手性原料出发合成光学纯L-草铵膦。化学不对称合成法工艺步骤多、收率低，手性原料昂贵导致生产成本高，不利于大规模制备L-草铵膦。生物催化法生产草铵膦则具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。主要包括以下三类：(1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要优点是转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料为前体。(2)以外消旋草铵膦的前体为底物，通过酶的选择性拆分获得。主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但是理论收率只能达到50％，造成原料浪费。(3)以D,L-草铵膦为原料，经D-氨基酸氧化酶催化D-草铵膦得到L-草铵膦前体2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(简称PPO)，再经转氨酶催化得到L-草铵膦。早在研究草铵膦在土壤微生物的代谢途径中就已经发现L-草铵膦在酶的作用下会被分解成2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸。因此，以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为底物，经酶法可逆催化生成L-草铵膦不失为一个好方法。D-氨基酸氧化酶是一类特异选择性的将D-氨基酸及其衍生物催化生成α-酮酸的酶，反应由其本身自带的辅酶FAD催化完成，因其表现处的优良催化效率和选择性，D-氨基酸氧化酶被广泛用于生物拆分L-氨基酸和α酮酸的生产。例如，D-氨基酸氧化酶转化头孢菌素C为戊二酰-7-氨基头孢烯酸。转氨酶是磷酸吡哆醛(PLP)依赖性酶，属于转移酶类，催化氨基与酮基互换的过程。它广泛存在于自然界中并在细胞的氮代谢过程中发挥重要的氨基转移作用。转氨酶有很多优点，比如高对映体选择性和区域选择性，高反应速率和稳定性等。转氨作用是一个可逆反应，2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸可在转氨酶的催化作用下通过逆反应生成L-草铵膦。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的不足，提供了一种全新的拆分消旋混合物制备L-草铵膦的方法。同时提供一种D-氨基酸氧化酶突变体，具有较高的催化D-草铵膦反应生成2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的活性。一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备L-草铵膦的方法，以D,L-草铵膦为原料，经酶催化体系催化获得L-草铵膦，所述酶催化体系包括用于将D,L-草铵膦中的D-草铵膦催化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的D-氨基酸氧化酶突变体、以及用于将2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸催化还原为L-草铵膦的转氨酶，所述D-氨基酸氧化酶突变体由野生菌Rhodotorulataiwanensis中的D-氨基酸氧化酶突变所得，突变位点选自以下四种中的一种：(1)M213S；(2)M213S-N54V-F58E；(3)M213S-N54V-F58E-D207A；(4)M213S-N54V-F58E-D207A-S60T。具体原理为：采用一锅法的多酶催化体系，以外消旋D,L-草铵膦为底物，利用D-氨基酸氧化酶将D-草铵膦催化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，同时，加入的过氧化氢酶用于去除副产物过氧化氢，因为过氧化氢积累会对催化剂有毒害作用，而L-草铵膦不参与反应而完全保留；然后，2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸被转氨酶催化还原为L-草铵膦，从而实现D,L-草铵膦的原位去消旋化，得到光学纯的L-草铵膦。转氨酶在催化过程中需要磷酸吡哆醛为辅酶，以氨基供体为辅底物。本申请中转氨酶可以采用本领域常规的序列。优选的，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示。在用于催化D-草铵膦反应生成2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸时，可以使用表达后的粗酶液或表达纯化后的酶液，也可以直接使用能够表达所述D-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌进行催化反应。相同的，转氨酶也可以直接加表达后的粗酶液、表达纯化后的纯酶液或直接加能够表达该转氨酶的基因工程菌。更优选的，所述D-氨基酸氧化酶突变体通过在反应体系中加入表达所述D-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌获得；所述转氨酶通过在反应体系中加入表达所述转氨酶的基因工程菌获得，同时还加有辅酶磷酸吡哆醛。更优选的，所用基因工程菌的宿主细胞均为E.coliBL21(DE3)。更优选的，反应体系中D,L-草铵膦的终浓度为100～400mM，表达所述D-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌添加量为20～40g/L，过氧化氢酶浓度为0.1g/L，表达所述转氨酶的基因工程菌添加量为30～50g/L，所述辅酶磷酸吡哆醛的浓度为1mM。反应的温度为30℃，时间为10h，反应的pH值为8。反应完成后，终产物L-草铵膦分离提取的方法为预处理-离子交换法-结晶。本专利技术又提供了一种D-氨基酸氧化酶突变体，由野生菌Rhodotorulataiwanensis中的D-氨基酸氧化酶突变所得，突变位点选自以下四种中的一种：(1)M213S；(2)M213S-N54V-F58E；(3)M213S-N54V-F58E-D207A；(4)M213S-N54V-F58E-D207A-S60T。本专利技术还提供了本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备L-草铵膦的方法，以为原料，经酶催化体系催化获得L-草铵膦，其特征在于，所述酶催化体系包括用于将D,L-草铵膦中的D-草铵膦催化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的D-氨基酸氧化酶突变体、以及用于将2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸催化还原为L-草铵膦的转氨酶，/n所述D-氨基酸氧化酶突变体由野生菌Rhodotorula taiwanensis中的D-氨基酸氧化酶突变所得，突变位点选自以下四种中的一种：/n(1)M213S；/n(2)M213S-N54V-F58E；/n(3)M213S-N54V-F58E-D207A；/n(4)M213S-N54V-F58E-D207A-S60T。/n

【技术特征摘要】
1.一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备L-草铵膦的方法，以为原料，经酶催化体系催化获得L-草铵膦，其特征在于，所述酶催化体系包括用于将D,L-草铵膦中的D-草铵膦催化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的D-氨基酸氧化酶突变体、以及用于将2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸催化还原为L-草铵膦的转氨酶，
所述D-氨基酸氧化酶突变体由野生菌Rhodotorulataiwanensis中的D-氨基酸氧化酶突变所得，突变位点选自以下四种中的一种：
(1)M213S；
(2)M213S-N54V-F58E；
(3)M213S-N54V-F58E-D207A；
(4)M213S-N54V-F58E-D207A-S60T。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述D-氨基酸氧化酶突变体通过在反应体系中加入表达所述D-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌获得；
所述转氨酶通过在反应体系中加入表达所述转氨酶的基因工程菌获得，同时还加有辅酶磷酸吡哆醛。


4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所用基因工程菌的宿主细胞均为E.co...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚平，程峰，王柳玉，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33