一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法、草铵膦脱氢酶突变体及应用技术

本发明专利技术公开了一种生物酶法去消旋化制备L‑草铵膦的方法、草铵膦脱氢酶突变体及应用。一种生物酶法去消旋化制备L‑草铵膦的方法，以D,L‑草铵膦为原料，经多酶催化体系催化获得L‑草铵膦，所述酶催化体系包括用于将D,L‑草铵膦中的D‑草铵膦催化为2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的D‑氨基酸氧化酶、以及用于将2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸催化还原为L‑草铵膦的草铵膦脱氢酶突变体，所述草铵膦脱氢酶突变体由野生菌Thiopseudomonas denitrificans中的草铵膦脱氢酶突变所得，突变位点为：V377S。本发明专利技术草铵膦脱氢酶突变体具有更好的催化效率，以外消旋D,L‑草铵膦为底物进行催化反应时，转化率远高于野生型酶，PPO产率也大幅提升。

【技术实现步骤摘要】
一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法、草铵膦脱氢酶突变体及应用
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法、草铵膦脱氢酶突变体及应用。
技术介绍
草铵膦，又名草丁膦，英文名为Phosphinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(几经合并后现归属拜耳公司)开发生产。草铵膦属膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成酶抑制剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂。众所周知，灭生性除草剂市场巨大。目前，世界三大除草剂分别为百草枯，草甘膦，草铵膦。在市场使用方面，草甘膦独占鳌头，但是由于其长期使用，使得大量杂草产生抗性，而草甘膦也趋于失效；百草枯由于其剧毒性，已被列入《鹿特丹公约》，全球越来越多国家禁用或限用，中国农业部已发布公告说明，百草枯在2014年7月1日停止生产，2016年7月1日禁止使用；而目前草铵膦产量虽小，却具有优异的除草性能和较小的药害副作用，因此，在未来一段时间内拥有巨大的市场潜力。草铵膦由两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有除草活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。手性纯L-草铵膦的主要制备方法主要由三种：手性拆分法，化学合成法和生物催化法。手性拆分法是通过对外消旋D,L-草铵膦或其衍生物进行手性拆分，实现D型和L型异构体的分离，从而得到光学纯的L-草铵膦。此工艺主要存在以下缺点：需要使用昂贵手性拆分试剂、理论收率只能达到50％、单次拆分率低、工艺比较复杂。化学合成法是从手性原料出发合成光学纯L-草铵膦。化学不对称合成法工艺步骤多、收率低，手性原料昂贵导致生产成本高，不利于大规模制备L-草铵膦。生物催化法生产草铵膦则具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。主要包括以下两类：(1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要优点是转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料为前体。(2)以外消旋草铵膦的前体为底物，通过酶的选择性拆分获得。主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但是理论收率只能达到50％，造成原料浪费。除了这两种传统的生物催化法，以D,L-草铵膦为原料的去消旋合成方法凸显了巨大的成本优势。由于市售的草铵膦为D,L-草铵膦，其工业化生产技术已十分成熟，去消旋合成方法直接以D,L-草铵膦为原料，简单易得，成本较低，较好对接现有草铵膦工业生产体系。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的不足，提供了一种草铵膦脱氢酶突变体，具有较高的催化活性，并将其应用在一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法。一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法，以D,L-草铵膦为原料，经多酶催化体系催化获得L-草铵膦，所述酶催化体系包括用于将D,L-草铵膦中的D-草铵膦催化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的D-氨基酸氧化酶、以及用于将2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸催化还原为L-草铵膦的草铵膦脱氢酶突变体，所述草铵膦脱氢酶突变体由野生菌Thiopseudomonasdenitrificans中的草铵膦脱氢酶突变所得，突变位点为：V377S。草铵膦脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQIDNo.4所示，基因序列如SEQIDNo.3所示。优选的，所述D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列如SEQIDNo.9所示。D-氨基酸氧化酶的基因序列如SEQIDNo.10所示。所述酶催化体系还包括用于去除副产物过氧化氢的过氧化氢酶。副产物过氧化氢的积累会对生物催化剂有毒害作用。过氧化氢酶来源于Parageobacillus，过氧化氢酶的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示，基因序列如SEQIDNo.8所示。所述酶催化体系还包括辅酶循环系统，所述辅酶循环系统为以下至少一种：(1)甲酸脱氢酶辅酶循环系统：包括甲酸脱氢酶，甲酸盐和辅酶；(2)葡萄糖脱氢酶辅酶循环系统：包括葡萄糖脱氢酶，葡萄糖和辅酶；(3)乙醇脱氢酶辅酶循环系统：包括乙醇脱氢酶，异丙醇和辅酶。上述各脱氢酶辅酶循环系统中使用的辅酶为NADPH与NADP之间的循环再生，或者为NADH与NAD之间的循环再生。由于反应过程中辅酶是循环再生的，所以初始添加时，可以添加NADPH/NADH或者NADP/NAD中的一类，或者两类都添加。所述甲酸脱氢酶来源于乳杆菌属Lactobacillusbuchneri，氨基酸序列如SEQIDNo.13所示；所述葡萄糖脱氢酶来源于微小杆菌属Exiguobacteriumsibiricum，氨基酸序列如SEQIDNo.11所示；所述乙醇脱氢酶来源于乳杆菌属Lactobacillusbrevis，氨基酸序列如SEQIDNo.15所示。本申请生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法，各种酶添加到反应体系中时，可以使用基因工程菌表达后的粗酶，也可以使用纯化后的酶，或者也可以直接向反应体系中加入表达各种酶的基因工程菌表达产生各酶，各酶可以是使用能够单独表达一种酶的多种基因工程菌，也可以将各酶的基因克隆到同一种基因工程菌中，使用能够表达多种酶的一种基因工程菌。本专利技术又提供了一种草铵膦脱氢酶突变体，由野生菌Thiopseudomonasdenitrificans中的草铵膦脱氢酶突变所得，突变位点为：V377S。本专利技术又提供了编码所述草铵膦脱氢酶突变体的基因，核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。本专利技术又提供了包含所述基因的基因工程菌。本专利技术还提供了所述草铵膦脱氢酶突变体、所述基因或所述基因工程菌在制备L-草铵膦中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术草铵膦脱氢酶突变体具有更好的催化效率，以外消旋D,L-草铵膦为底物进行催化反应时，转化率远高于野生型酶，PPO产率也大幅提升。(2)本专利技术以外消旋D,L-草铵膦为底物，利用D-氨基酸氧化酶、去过氧化氢系统、草铵膦脱氢酶突变体和辅酶循环系统将D-草铵膦氧化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，L-草铵膦因不参与反应而被完全保留；产物2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸又可以被继续催化还原为L-草铵膦，进而实现D,L-草铵膦的原位去消旋化。(3)本专利技术能够直接以D,L-草铵膦为底物进行拆分，无需昂贵的拆分试剂，也无需合成草铵膦衍生物，更无需对D-草铵膦进行分离、再消旋、再拆分等步骤。附图说明图1去消旋合成L-草铵膦的反应式(葡萄糖脱氢酶辅酶循环系统)。图2去消旋合成L-草铵膦的反应式(甲酸脱氢酶辅酶循环系统)。图3去消旋合成L-草铵膦的反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法，以D,L-草铵膦为原料，经多酶催化体系催化获得L-草铵膦，其特征在于，所述酶催化体系包括用于将D,L-草铵膦中的D-草铵膦催化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的D-氨基酸氧化酶、以及用于将2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸催化还原为L-草铵膦的草铵膦脱氢酶突变体，/n所述草铵膦脱氢酶突变体由野生菌Thiopseudomonas denitrificans中的草铵膦脱氢酶突变所得，突变位点为：V377S。/n

【技术特征摘要】
1.一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法，以D,L-草铵膦为原料，经多酶催化体系催化获得L-草铵膦，其特征在于，所述酶催化体系包括用于将D,L-草铵膦中的D-草铵膦催化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的D-氨基酸氧化酶、以及用于将2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸催化还原为L-草铵膦的草铵膦脱氢酶突变体，
所述草铵膦脱氢酶突变体由野生菌Thiopseudomonasdenitrificans中的草铵膦脱氢酶突变所得，突变位点为：V377S。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列如SEQIDNo.9所示。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶催化体系还包括用于去除副产物过氧化氢的过氧化氢酶。


4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶催化体系还包括辅酶循环系统，所述辅酶循环系统为以下至少一种：
(1)甲酸脱氢酶辅酶循环系统：包括甲酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚平，程峰，曹成浩，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33