用于检测乳腺癌的miRNA标记物组合、试剂盒和方法技术

本发明专利技术提供一种生物标记物技术，其用于通过组合地测定在人外周血液中循环的两种或更多种miRNA的表达量，从而以高的特异性和灵敏度来诊断检查对象者的乳腺癌。不论乳腺癌的类型、临床病期、人种的差异如何，都能够使用共同的miRNA标记物，均具有高的检测灵敏度和特异度。这些乳腺癌标记物是从多个队列研究中得到证实的miRNA，是能够作为乳腺癌生物标记物直接用于临床检查的技术。

【技术实现步骤摘要】
用于检测乳腺癌的miRNA标记物组合、试剂盒和方法
本申请涉及一种生物标记物技术，其用于以从检查对象者采取的血清或血浆为对象来检查乳腺癌。
技术介绍
乳腺癌是威胁女性健康的主要疾病之一。根据世界卫生组织(WHO：WorldHealthOrganization)2008年的统计，在全世界中乳腺癌排在成年女性的死因的第五位。乳腺癌根据其基因类型大致分为LuminalA型、LuminalB型、HER2Rich以及TripleNegative型这四种，已知对抗癌剂的敏感性不同等作为癌细胞的性质和恶性度的差异。在LuminalA和B型中，雌激素受体(EstrogenReceptor；ER)和孕激素受体(ProgesteroneReceptor；PgR)为阳性，在LuminalB型和HER2Rich型中，HER2受体为阳性。此外，在从癌的浸润的发展程度观察的情况下，阶段分类为阶段0、阶段Ⅰ、阶段Ⅱ、阶段Ⅲ、阶段Ⅳ这5期，在从转移的发展程度观察的情况下，TNM分类为原发肿瘤(Tumor；T)、淋巴结转移(Lymphnodes；N)、远隔转移(Metastasis；M)。乳腺癌生长为1cm需要15年，但1cm的癌生长为2cm不需要2年。在早期癌(阶段Ⅰ)之前实施了治疗的情况下的5年生存率维持约98％，但在乳腺癌的发现晚至确认达到阶段Ⅲ的淋巴结转移的情况下，5年生存率降低至约68％，因此认识到早期发现是重要的。被称为早期癌(阶段Ⅰ)的阶段通常是指2cm以下的肿瘤体积，因此为了早期发现乳腺癌建议两年诊查一次。癌症诊查的目的在于，通过癌症的发现来展开救命治疗，降低癌症的死亡率。为了早期发现，存在灵敏度和特异性高的检查法和受诊者前往诊查是重要的。当前的乳腺癌诊查包括进行问诊、望诊触诊、X射线摄影乳房摄影检查、超声波诊查这四种。即使在日本，从2000年引入的乳房摄影检查也有时存在对于乳腺密集的年轻女性而言被拍摄得整体发白而难以检查的情况，自治体进行的居民诊查以40岁以上为对象。虽然对微细的乳腺癌的发现发挥威力，但会因将乳房夹入摄影装置中而引起疼痛，因此也成为患者不愿自主前往诊查的主要原因。在乳房摄影检查中，进入到精密检查的比例为5％左右，最终被诊断为乳腺癌的为约0.3％，因此假阳性高也上升为一个课题。超声波检查以不作为对策型乳腺癌诊查对象的20岁、30岁的一代为对象来实施，但为了辨别癌症而需要高度熟练的检查技师、医师，因此医疗机构的检查精度参差不齐也成为课题。在发展中国家，由于平均寿命的延长、生活习惯的现代化等，癌症患者数正在持续增加，在全世界2012年的癌症导致的死亡例中，发展中地区占比约65％。在这些国家，特别是乳腺癌导致的死亡急剧增加。也存在难以配备发达国家那样的检查医疗设施的经济情况，期待引入不需要高额的设备投资的检查方法来改善该现状。作为其代表性的方法可以想到的是通过分析存在于唾液、尿、血清等生物体样品中的疾病特异成分来确定癌症的生物标记物技术。作为癌症筛查用生物标记物最著名的是用于前列腺癌的检查的前列腺特异性抗原(PSA：ProstateSpecificAntigen)，在引入PSA检查前，发展为转移癌而被发现的患者为约60％，相对于此，在引入该检查后，其降低至约10％，通过早期发现有助于延长剩余寿命期限。前列腺癌难以出现初期症状，因此定期的癌症诊查是重要的，即使在这样的情况下，癌症检查简便、精度高且便宜，对于检查受诊者而言身体的负担低也是重要的。毕竟，即使确立了良好的癌症检查方法，如果不接受检查，则也无法实现癌症导致的死亡率的降低。因此，对于检查法而言，受诊者能够轻松地前往检查也是极其重要的。作为最常用的血清中的乳腺癌标记物，存在CA15-3(carbohydrateantigen15-3：糖类抗原15-3)，但除了乳腺癌之外，其有时在肺癌、前列腺癌、肝炎等中也会上升，不能说是对于乳腺癌的特异性高。此外，CA15-3的正常范围被设为25U/ml，但在该截止值中，初期阶段的乳腺癌的阳性率停留在10％左右，CA15-3对于早期诊断不太起作用。作为其他血清标记物，还利用了CEA(carcinoembryonicantigen：癌胚抗原)，但其灵敏度比CA15-3更低。这些血清标记物主要用于转移性乳腺癌的治疗监控。如此，在癌症诊查的技术开发中，必须考虑因检查的精度不够或灵敏度不够而导致的假阳性或假阴性、因过度诊断而导致的不利、以及身体侵袭性。例如过度诊断之一有癌前病变，但实际发展为癌症只不过为百分之几。如果为甚至检测到癌前病变的癌症诊查标记物，则产生进行之后的详细检查的检查机构的处理能力的问题，成为担心检查受诊者的精神负担的事态。因此，需要配合在科学上确立了有效性的早期诊查技术和检查的精度管理。近年来，报道了许多暗示血清中的miRNA对癌症诊断的有用性的研究。miRNA是18～25碱基的RNA，于1993年在线虫中首次被发现。miRNA具有如下作用：通过部分地或完全地与具有互补性的mRNA的3’端非翻译区结合，来抑制该mRNA的分解或蛋白质翻译。已知：miRNA靶向的mRNA一般存在多个，一个miRNA对多样的基因表达带来影响。在2014年的时候，作为对miRNA进行编码的染色体上的区域，报道了1881处(miRbasehttp://www.mirbase.org/blog/2014/06/mirbase-21-finally-arrives/)。在2019年，登记了2656种人的RNA。微RNA不仅包含于细胞、组织中，还包含于唾液、血液等中，因此能够容易地进行检查样本的采取，因此作为新的液体活检在全世界中备受关注。关于微RNA和癌症，作为最初期的事例已知有与慢性淋巴性白血病的关连性的报道，之后，截止目前为止，存在许多支持作为癌症诊断标记物的有用性的研究报道[非专利文献1]。其中，乳腺癌和微RNA的研究是最盛行的对象之一。在可以获知的范围内，2005年报道了最初的乳腺癌与微RNA的关连性。以下记载事例。在现有研究中，有如下报道：对接受了抗癌剂治疗的乳腺癌患者的血浆miR-221进行了解析，其结果是，miR-221与总缓解率(OverallResponseRate)高度相关(p＝0.044)，另一方面，与病理学完全缓解(pathologicalcompleteresponse)的相关是部分的(p＝0.477)[非专利文献2]。此外，根据另一报道，在乳腺癌组织中，miR-221是伴随着乳腺癌的恶性化、远隔转移而表达上升的生物标记物[非专利文献3]。接着，作为miR-155辅助关于是否具有乳腺癌或者具有产生乳腺癌的风险的检测的方法，已经申请了专利[专利文献1]。此外，报道了：对于miR-155，通过定量RT-PCR来评价了癌症患者血清(n＝103)，其结果是，与健康人的血清(n＝55)相比，确认到表达显著上升，平均表达量的差异为2.94倍[非专利文献4]。该报道中的miR-155的乳腺癌感测的特异性和灵敏度分别为65.0％、81.8％，曲线下面积(AUC)为0.801，在阶段Ⅰ至Ⅳ的任一种中，观察到显著的表达上升。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测乳腺癌的miRNA标记物组合，其特征在于，所述miRNA标记物组合包括选自miR-101、miR-221和miR-155的至少两种标记物，/n其中所述miR-101具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；/n所述miR-221具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；并且/n所述miR-155具有如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测乳腺癌的miRNA标记物组合，其特征在于，所述miRNA标记物组合包括选自miR-101、miR-221和miR-155的至少两种标记物，
其中所述miR-101具有如SEQIDNO.1所示核苷酸序列；
所述miR-221具有如SEQIDNO.2所示核苷酸序列；并且
所述miR-155具有如SEQIDNO.3所示核苷酸序列。


2.根据权利要求1所述的miRNA标记物组合，其特征在于，所述乳腺癌为LuminalA型、LuminalB型、HER2Rich型或TripleNegative型。


3.根据权利要求1或2所述的miRNA标记物组合，其特征在于，所述乳腺癌处于临床病期0期、I期、II期、III期或IV期。


4.权利要求1-3中任一项所述的miRNA标记物组合在制备用于检测乳腺癌的试剂盒中的应用。


5.一种检测乳腺癌的方法，其特征在于，所述方法包括：检测来自受试者的样品中权利要求1-3中任一项所述的miRNA标记物组合中每种标记物的水平，其中若每种标记物的水平与对照值相比均增加，则表示所述受试者患有乳腺癌。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述增加是在统计学上的显著增加。


7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述对照值是不患有乳腺癌的人或患有乳房良性纤维腺瘤的人的样品中每种标记物的水平。


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【专利技术属性】
技术研发人员：落谷孝広，
申请(专利权)人：上海圣梓茂生物科技有限公司，上海圣特佳健康科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31