一种诊断结直肠癌肝转移的标志物制造技术

本发明专利技术公开了一种诊断结直肠癌肝转移的标志物，为人血浆外泌体中的hsa_circ_0080091。本发明专利技术利用微阵列分析用于检测血浆外泌体中差异表达的circRNA，并证实这些候选circRNA确实存在差异并且可以用作潜在的结直肠癌肝转移诊断生物标记。结果发现结直肠癌患者血浆外泌体中的hsa_circ_0080091表达改变可以作为诊断结直肠癌肝转移的标志物，这将有助于探索这种疾病的发病机理，并为CRC的诊断提供新的方向。

【技术实现步骤摘要】
一种诊断结直肠癌肝转移的标志物
本专利技术属于结直肠癌诊断
，具体涉及一种作为诊断结直肠癌肝转移标志物的血浆外泌体circRNA。
技术介绍
结直肠癌(Colorectalcancer，CRC)作为消化系统常见肿瘤，其发病率和死亡率一直持逐年升高的趋势，根据2018年最新的全球癌症统计数据显示，在统计的36种癌症中，结直肠癌发病率排名第三位10.2％，死亡率排名第二位9.2％。而结直肠癌肝转移(Colorectalcancerlivermetastasis，CRLM)是结直肠癌患者最主要的死亡原因。在2018年中国结直肠癌肝转移诊断和综合治疗指南中显示，未经治疗的结直肠癌肝转移患者的中位生存期仅6.9个月，无法切除患者的5年生存率低于5％；而肝转移病灶能完全切除患者的中位生存期为35个月。由此可见，早期诊断结直肠肝转移对患者的预后至关重要。目前对于结直肠癌肝转移的诊断主要通过肝脏超声、CT、肝脏MRI；经皮穿刺活检作为有创性检查在临床上也仅限于病情需要时应用；血液肿瘤标志物CEA、CA19-9对结直肠癌肝转移的早期诊断也缺乏特异性，因此寻找具有特异性的早期诊断结直肠肝转移的分子标志物仍是学者们关注的问题。外泌体是直径为40-100nm的纳米级双层膜囊泡，通常以杯形出现。多种人类细胞可以通过细胞外分泌释放外泌体，这些囊泡广泛分布于血液，唾液，尿液和其他体液中。外泌体可以携带脂质体，蛋白质，mRNA和非编码RNA到达靶组织，并且可以参与细胞通讯，免疫反应以及肿瘤的生长和迁移。研究发现，circRNA在外泌体中稳定且丰富。环状RNA(circRNA)是一类天然存在的非编码RNA，通过反向剪接前体RNA(pre-mRNA)形成共价闭合结构。CircRNA具有重要的特性，如通用性，保守性，稳定性和组织或发育阶段特异性，这也使其成为临床疾病的潜在理想诊断标记。circRNA的研究最广泛的作用是作为microRNA(miRNA)的海绵，后者通过与miRNA反应元件(MRE)相互作用来调节下游基因。与血液中游离的RNA相比，测量外泌体衍生的RNA作为生物标记具有许多优势。一方面，外泌体膜可以有效地保护内含物免受RNase降解，从而保持循环血液中外泌体RNA的完整性和功能性。另一方面，癌细胞将外泌体分泌到外周循环液中，而外泌体RNA可以更准确地反映出肿瘤演化过程中癌细胞的变化。circRNA稳定且在血液，唾液和外泌体中含量丰富，是癌症早期诊断和预后的有希望的指标。人血清外泌体包含大量完整和稳定的circRNA，其作为未来肿瘤检测的生物标志物具有巨大潜力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种诊断结直肠癌肝转移的标志物。一种诊断结直肠癌肝转移的标志物，为人血浆外泌体中的hsa_circ_0080091。所述hsa_circ_0080091在结直肠癌肝转移患者的血浆外泌体中表达量升高。结直肠癌原发灶与肝转移灶中hsa_circ_0080091与FGFR3的表达水平与miR-99b-5p呈现负相关趋势。一种诊断结直肠癌肝转移的试剂盒，包括hsa_circ_0080091。hsa_circ_0080091、miR-99b-5p和FGFR3在调控结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术利用微阵列分析用于检测血浆外泌体中差异表达的circRNA(DE-circRNA)，并证实这些候选circRNA确实确实存在差异并且可以用作潜在的结直肠癌诊断生物标记。结果发现结直肠癌患者血浆外泌体中的hsa_circ_0080091表达改变可以作为诊断结直肠癌肝转移的标志物的组合，这将有助于探索这种疾病的发病机理，并为CRC的诊断提供新的方向。本专利技术还发现结直肠癌原发灶与肝转移灶中hsa_circ_0080091与FGFR3的表达水平与miR-99b-5p呈现负相关趋势；干扰或增强细胞中miR-99b-5p的表达，影响结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力；在结直肠癌中具有调控作用。附图说明图1为外泌体的TEM图像(比例尺，100nm)。图2为血清外泌体NTA分析确认的外来体的大小范围。图3为差异表达的circRNA的热图分析。图4为差异表达的circRNA的火山图分析。图5为qRT-PCR检测has_circ_0080091在CRLM患者血清外泌体中表达上调。图6为血清外泌体has_circ_0080091、CEA、CA19-9单独诊断效能。图7为has_circ_0080091、CEA、CA19-9联合诊断效能。图8为干扰或增强细胞中miR-99b-5p的表达，影响结直肠癌细胞的增殖、能力。图9为干扰或增强细胞中miR-99b-5p的表达，影响结直肠癌细胞的迁移、侵袭能力。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。下述实施例中人CRC细胞系(SW480，SW620，LoVo，HT-29)和正常NCM460结肠上皮细胞购自中国科学院上海生物科学研究所。所有细胞系均在合适的培养环境(5％CO2，37℃)下保存在补充有10％FBS(Gibco)的RPMI1640培养基(Gibco，美国)中。实施例1外泌体的获取使用超速离心从血浆中提取外泌体。解冻后，首先将血浆样品以500g离心5分钟，然后将上清液转移至新的聚碳酸酯试管中，并以2000g离心10分钟。然后将它们以10,000g离心30分钟，以消除脱落的微囊泡(sMV)。收集上清液，并通过0.22μm的膜滤器(MerckMillipore)渗滤，并进一步以100,000g离心2小时。将外泌体沉淀用PBS洗涤一次，并重复先前的步骤。最后，将外泌体悬浮在PBS中，并保存在-80℃下以备后用。将通过上述方法获得的10微升悬浮的外泌体置于铜网上，静置10分钟，并用2％乙酸铀酰水溶液染色3分钟。使用滤纸擦去多余的染料，并将样品在室内温度下风干。然后通过日立H-7650透射电子显微镜(TEM)观察外泌体(图1)。同时，使用来自ParticleMetrix(德国)的ZetaView粒子追踪器通过纳米粒子追踪分析(NTA)计算了外泌体的浓度和大小分布(图2)。随后，通过蛋白质印迹检测外泌体生物标志物，例如四跨膜蛋白分子CD63(Abcam)，CD9(Abcam)和TSG101(Abcam)。实施例2微阵列分析分析1例直肠癌原发患者和1例结直肠癌肝转移患者血清外泌体中circRNA差异表达谱。根据Arraystar的标准方案完成样品制备和微阵列杂交。简而言之，用RnaseR(Epicentre，Inc.)消化总RNA，以消除外泌体中线性RNA并富集circRNA，然后使用随机引物技术(ArraystarSuperRNALa本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诊断结直肠癌肝转移的标志物，其特征在于，为人血浆外泌体中的hsa_circ_0080091。/n

【技术特征摘要】
1.一种诊断结直肠癌肝转移的标志物，其特征在于，为人血浆外泌体中的hsa_circ_0080091。


2.根据权利要求1所述诊断结直肠癌肝转移的标志物，其特征在于，所述hsa_circ_0080091在结直肠癌肝转移患者的血浆外泌体中表达量升高。


3.根据权利要求1-2所述诊断结直肠癌肝转移的标志物，其特征在于，结...

【专利技术属性】
技术研发人员：张力图，刘海洲，宁淑芳，利基林，
申请(专利权)人：广西医科大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：广西;45