核酸提取用固相基底的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种核酸吸附基质修饰固相基质的制备方法及其在核酸分离中的应用，主要步骤包括以下内容：1)修饰固相基质连续内表面，以便于提供结合核酸吸附基质的所需的离子、共价或其他化学键；2)将核酸吸附基质溶解在MES缓冲液或醋酸溶液中，然后注入固相基质连续内表面形成涂层；3)裂解液裂解含有病原体的样本后，使用结合液调制裂解液以提供核酸吸附基质吸附核酸所需的环境，然后将溶液注入固相基质中；4)使用pH介于3‑10之间的任意清洗缓冲液清洗固相基质，清除杂质；5)将pH>8的低盐洗脱缓冲液注入固相基质连续内表面中，以便于洗脱核酸或直接进行扩增检测。

【技术实现步骤摘要】
核酸提取用固相基底的制备方法及其应用
本专利技术涉及核酸提取
，具体而言，涉及一种核酸提取用固相基底的制备方法及其应用。
技术介绍
核酸提取对于后续的聚合酶链反应(PCR)或等温扩增等过程至关重要。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染的肺炎疫情暴发以来，普通实时荧光定量PCR核酸检测试剂的迅速上市和临床应用在患者临床诊断和疑似患者排查中发挥了重要作用，但是受核酸提取操作繁琐、耗时长、需要集中送检等限制，还不能满足当前快速增长的大量疑似患者、无症状感染者等排查诊断的检测需求。这就对于研发适用于现场应用的新型核酸提取方法、提取试剂盒和提取系统提出了需求。传统的核酸提取纯化方法包括液-液提取纯化法、固相提取纯化(SPE)法。酚-氯仿提取是一种液-液核酸提取法，需使用酚、氯仿等高毒性的试剂，操作步骤复杂，耗时长，涉及多步离心，剪切力可能降解核酸，不适于自动化和微型化。基于硅基质的固相萃取方法虽然操作简单，能够省去一些有毒有机溶剂的使用，但由于固液分离仍然依靠多步离心导致耗时长，而且也容易对核酸造成损伤；另外丙醇等离液试剂的加入，一方面会抑制下游PCR聚合酶的活性，另一方面清洗步骤变得严格、繁琐和冗长，进而降低核酸回收率。基于磁性材料的磁性固相萃取技术避免了离心分离步骤产生的剪切力而使核酸降解的可能性，但作为固相吸附剂的磁性微粒需要通过外加磁场实现分离，这明显增加了核酸提取操作过程的复杂性。考虑到所有技术开发都应以应用为目的，一种理想的方法在提供高质量、高纯度核酸的同时，还应尽量在短时间内完成，这对于RNA提取十分重要。这主要是由于RNA酶在细胞裂解物本身和环境中普遍存在，RNA更容易在细胞裂解过程中降解。此外，这样的方法还应该尽可能地简化操作过程，并且应该非常适合与后续扩增过程集成。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的首要目的在于提供核酸提取用固相基底的制备方法，即核酸吸附基质与固相基底连续内表面，通过离子、共价或其他化学键化学键合等方法结合，进而完成核酸提取用固相基底的制备，该制备方法简单，条件温和，重现性好。第一方面，本专利技术提供了一种核酸提取用固相基底的制备方法，包括以下步骤：1)对固相基底进行前处理；2)对步骤1)前处理后的固相基底连续内表面修饰核酸吸附基质；3)对步骤2)处理后的固相基底进行清洗，去除未结合的核酸吸附基质；4)对步骤3)处理后的固相基底进行干燥烘干。在具体实施方式中，步骤1)所述固相基底选自离心管或微型离心管、微流控芯片、孔板或深孔板、槽或深槽中的一种或几种；所述前处理为采用化学修饰方法在固相基底上修饰羧基、羟基和碳氧双键，优选地，所述化学修饰方法为采用铬酸和硫酸组合配置的氧化溶液，通入固相基底，在室温下反应过夜。在具体实施方式中，步骤2)所述核酸吸附基质为聚-β-(1,4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖或聚乙烯亚胺或聚多巴胺或3-氨丙基三乙氧基硅烷或3-氨丙基(二乙氧基)甲基硅烷或3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷或二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷或聚苯胺或聚吡咯或多聚赖氨酸或多聚组氨酸或聚亚乙基亚胺或聚烯丙基胺或聚β-(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖中的一种；优选地，所述核酸吸附基质为聚-β-(1,4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，浓度为0.1％-5％(w/v)。在具体实施方式中，采用缓冲液对核酸吸附基质进行溶解，制备获得核酸吸附基质悬浮液，并加入步骤1)前处理后的固相基底中，20-60℃下静置反应8～24h。在具体实施方式中，所述缓冲液为MES缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液，缓冲液浓度为20-100mM，pH为4-6。第二方面，本专利技术提供第一方面所述制备方法制得的核酸提取用固相基底。第三方面，本专利技术提供第一方面所述制备方法制得的核酸提取用固相基底进行核酸提取的方法，包括以下步骤：1)使用裂解液裂解样本；2)核酸吸附，使用结合液与步骤1)裂解后的样本按照1:1～1:2的比例混合，将形成的混合液注入固相基底中，接触时间1-15min；3)利用清洗缓冲液清洗固相基底，去除蛋白质或其他杂质；4)核酸洗脱，采用低盐洗脱缓冲液洗脱被吸附的核酸。在具体实施方式中，所述步骤1)中裂解液成分为100mMTris-HCl，10mMEDTA，1％SDS和10％TritonX-100。在具体实施方式中，所述步骤2)中结合液为异硫氰酸胍、氯化胍、氯化钠、氯化钾、氯化镁中的一种，结合液浓度范围为1.5-3mol/L，并含有浓度为0.01-1％(w/w)的CTAB，优选地结合液为异硫氰酸胍，浓度为2mol/L，并含有0.1％(w/w)的CTAB。在具体实施方式中，所述步骤3)中清洗缓冲液的pH范围为3-10，优选地pH范围为5-6；步骤4)中低盐洗脱缓冲液为Tris-HCl或Tris-EDTA，洗脱温度为50-90℃，洗脱时间为1-20min。在具体实施方式中，所述固相基底用于RNA类病毒核酸提取。以核酸吸附基质修饰的固相基底的连续内表面为核酸富集点，利用核酸吸附基质的分子结构特点，通过调节结合液和洗脱液的酸碱度实现对核酸的快速分离和富集，该方法具有很强的通用性和可操作性，实用价值高。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：在一定pH条件下，固相基底连续内表面的核酸吸附基质呈现出正电荷，与磷酸骨架带负电荷DNA和RNA结合，并在pH值升高(>8)并且正电荷被中和时，释放出DNA和RNA。本专利技术的固相基底以核酸吸附基质涂层为载体吸附核酸，利用核酸吸附基质与核酸的电荷吸附作用，只需要在固相基底中就可以实现对核酸的抓取，再通过电荷中和进行核酸洗脱，最后通过扩增检测来对所提取的核酸进行评价。基于核酸吸附基质修饰的固相基底的普适性和实用性为核酸提取提供了一种便捷的方法。本专利技术的基于核酸吸附基质修饰固相基底的核酸提取方法极大地简化了目前核酸提取的过程，优于传统的酚-氯仿法和商业化的试剂盒提取方法，在提取过程中不使用任何有毒的有机试剂，也无需繁琐的离心步骤，同时无需磁固相萃取技术中的外加磁场。将基于核酸吸附基质修饰固相基底的核酸提取方法与下游扩增检测技术相互整合，可以实现快速地对疑似样品中病原体的检测。本专利技术中，核酸吸附基质与固相基底，通过离子、共价或其他化学键化学键合等方法结合，除强碱性水溶液以外，核酸吸附基质与固相基底之间的结合在大多数环境中都能表现出良好的长期稳定性，这是传统改性或者粘附技术所无法实现的。附图说明图1为离心管连续内表面作为固相基质吸附核酸示意图；图2为微流控芯片作为固相基质吸附核酸示意图；图3为孔板连续内表面作为固相基质吸附核酸示意图；图4为槽连续内表面作为固相基质吸附核酸示意图；图5为不同结合液成分对核酸扩增Ct值的影响；图6为含有不同浓度异硫氰酸胍的结合液对核酸扩增Ct值的影响；图7为不同清洗缓冲液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸提取用固相基底的制备方法，包括以下步骤：/n1)对固相基底进行前处理；/n2)对步骤1)前处理后的固相基底连续内表面修饰核酸吸附基质；/n3)对步骤2)处理后的固相基底进行清洗，去除未结合的核酸吸附基质；/n4)对步骤3)处理后的固相基底进行干燥烘干。/n

【技术特征摘要】
1.一种核酸提取用固相基底的制备方法，包括以下步骤：
1)对固相基底进行前处理；
2)对步骤1)前处理后的固相基底连续内表面修饰核酸吸附基质；
3)对步骤2)处理后的固相基底进行清洗，去除未结合的核酸吸附基质；
4)对步骤3)处理后的固相基底进行干燥烘干。


2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述固相基底选自离心管或微型离心管、微流控芯片、孔板或深孔板、槽或深槽中的一种或几种；所述前处理为采用化学修饰方法在固相基底上修饰羧基、羟基和碳氧双键，优选地，所述化学修饰方法为采用铬酸和硫酸组合配置的氧化溶液，通入固相基底，在室温下反应过夜。


3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述核酸吸附基质为聚-β-(1,4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖或聚乙烯亚胺或聚多巴胺或3-氨丙基三乙氧基硅烷或3-氨丙基(二乙氧基)甲基硅烷或3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷或二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷或聚苯胺或聚吡咯或多聚赖氨酸或多聚组氨酸或聚亚乙基亚胺或聚烯丙基胺或聚β-(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖中的一种；优选地，所述核酸吸附基质为聚-β-(1,4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，浓度为0.1％-5％(w/v)。


4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，采用缓冲液对核酸吸附基质进行溶解，制备获得核酸吸附基质悬浮液，并加入步骤1)前处理后的固相基底中，20-60℃下静置反应8～24h。


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【专利技术属性】
技术研发人员：杨柯，朱灵，朱灿灿，赵俊，汪磊，王贻坤，邓国庆，刘勇，
申请(专利权)人：合肥中科易康达生物医学有限公司，中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：安徽;34