一种用于miRNA检测的逆转录-链置换扩增方法及应用技术

本发明专利技术公开一种用于miRNA检测的逆转录

【技术实现步骤摘要】
一种用于miRNA检测的逆转录
‑
链置换扩增方法及应用


[0001]本专利技术涉及核酸检测
，更具体地说，关于一种用于miRNA检测的逆转录
‑
链置换扩增方法及应用。

技术介绍

[0002]MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的、长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA，已被证明参与各类生命活动的调控。近年来，研究发现血清、血浆等体液中存在种类丰富的循环miRNA分子，通过定量检测受试者循环miRNA分子的表达水平，可以实现癌症的早期筛查和预后监测(参见例如单保恩等人，MicroRNA:癌症诊治新靶点，中国肿瘤生物治疗杂志，2014，第21卷第6期：603
‑
609)。
[0003]RT
‑
qPCR是定量检测miRNA的常用方法之一(参见Kramer M F,Curr.Protoc.Mol.Biol.2011,95(1):Chapter 15:Unit 15.10)；如专利CN105177132A公开了一种定量检测miRNA的RT
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于miRNA检测的逆转录
‑
链置换扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、miRNA单链进行poly(A)加尾反应，得到C1链；S2、逆转录反应：C1链在逆转录引物P1作用下，进行逆转录反应，生成与C1链反向互补的C2链，并作为cDNA模板，用于SDA反应检测miRNA目标分子；S3、SDA反应上游引物P2以C2链为模板，先后进行链杂交和延伸反应，生成C3链；所述上游引物P2的核苷酸序列如通式(I)所示：P
‑
F
ꢀꢀꢀ
(I)其中，P为RT
‑
SDA反应上游引物P2的5
’
端序列，包括切刻内切酶的酶切位点识别序列及其保护碱基；F为RT
‑
SDA反应上游引物P2的3
’
端序列，其核苷酸序列与任意一种miRNA目标分子5
’
端8
‑
14个碱基序列相同，除尿嘧啶残基被胸腺嘧啶残基替换外；S4、C3链与C2链形成互补的DNA双链后，在切刻内切酶的催化下，进行酶切反应，将C3链剪开一个切口；S5、C3链切口5
’
端的序列继续延伸，将C3链切口3
’
端的序列置换出去，生成C4链；同时，又形成新的C3
‑
C2 DNA双链结构，并持续重复步骤S4和S5反应，生成大量的C4链；S6、SDA反应下游引物P3或SDA反应下游探针P4以C4链为模板，先后进行链杂交和延伸反应，生成C5链；所述下游引物P3的核苷酸序列如通式(II)所示：P
‑
R
ꢀꢀꢀ
(II)其中，P为RT
‑
SDA反应下游引物P3的5
’
端序列，包括切刻内切酶的酶切位点识别序列及其保护碱基，R为所述RT
‑
SDA反应下游引物P3的3
’
端序列，其核苷酸序列与逆转录引物P1的5
’
端8
‑
14个碱基序列相同；所述下游探针P4的核苷酸序列如通式(III)所示：P
‑
B1
‑
B2
‑
R
ꢀꢀꢀ
(III)其中，P
‑
B1
‑
B2为RT
‑
SDA反应下游探针P4的5
’
端序列，包括切刻内切酶的酶切位点识别序列及其保护碱基；碱基B1和B2分别为标记的荧光基团和淬灭基团；R为RT
‑
SDA反应下游探针P4的3
’
端序列，其核苷酸序列与逆转录引物P1的5
’
端8
‑
14个碱基序列相同；S7、C5链与C4链形成互补的DNA双链后，在切刻内切酶的作用下，进行酶切反应，将C5链剪开一个切口；S8、C5链切口5
’
端的序列继续延伸，将C5链切口3
’
端的序列置换出去，生成C6链；同时，又形成新的C5
‑
C4 DNA双链结构，并持续重复步骤S7和S8反应，生成大量的C6链；S9、C6链与C2链序列完全相同，可持续进行步骤S4
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S5反应，生成大量的C4链，进而又持续进行步骤S7
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S8反应，并再次生成大量的C6链；扩增反应可循环往复持续进行，使得扩增产物和荧光信号呈指数增长。2.根据权利要求1所述的一种用于miRNA检测的逆转录
‑
链置换扩增方法，其特征在于：所述miRNA包括体液循环miRNA、新鲜组织或石蜡组织miRNA、总RNA、人工合成的miRNA分子中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的一种用于miRNA检测的逆转录
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链置换扩增方法，其特征在于：所述切刻内切酶包括Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nb.BssSI、Nt.CviPII中的任意一种。
4.用于miRNA检测的逆转录
‑
链置换扩增染料法试剂盒，其特征在于：所述染料法试剂盒包括如权利要求1
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3任一项所述的逆转录引物P1、上游引物P2和下游引物P3。5.根据权利要求4所述的用于miRNA检测的逆转录
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链置换扩增染料法试剂盒，其特征在于：所述染料法试剂盒还包括用于miRNA加尾逆转录反应的成分：Poly(A)聚合酶、逆转录酶、ATP、dNTPs和和反应缓冲液；所述反应缓冲液包括Tris
‑
HCl pH 8.3、NaCl、KCl、MgCl2、DTT；所述染料法试剂盒还包括进行链置换等温扩增反应的成分：DNA聚合酶、切刻内切酶、dNTPs、荧光染料和反应缓冲液；所述反应缓冲液包括Tris
‑
HCl pH 7.9、NaCl、MgCl2、BSA。6.根据权利要求4所述的用于miRNA检测的逆转录
‑
链置换扩增染料法试剂盒，其特征在于：所述染料法试剂盒在进行miRNA加尾逆转录时使用的各成分在反应体系中的浓度分别为：10
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100mM Tris
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HCl pH 8.3、10
‑
100mM NaCl、10
‑
100mM KCl、1
‑
50mM MgCl2、1
‑
100mM DTT、1
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50nM逆转录引物、0.1
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2.0mM ATP、0.1
‑
10U/μL Poly(A)聚合酶、1
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50U/μL逆转录酶、0.1
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2.0mM dNTP；所述染料法试剂盒在进行链置换等温扩增时使用的各成分在反应体系中的浓度分别为：10
‑
100mM Tris
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HCl pH 7.9、50
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200mM NaCl、5
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50mM MgCl2、50
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200μg/mL BSA、0.05
‑
0.5U/μL DNA聚合酶、0.05
‑
0.5U/μL切刻内切酶、0.025
‑
0.5mM dNTPs、0.025
‑
0.5μM上游引物、0.025
‑
0.5μM下游引物、1
×
荧光染料。7.根据权利要求4所述的用于miRNA检测的逆转录
‑
链置换扩增染料法试剂盒，其特征在于：所述染料法试剂盒在进行miRNA加尾逆转录时使用的各成分在反应体系中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵俊，朱灵，刘勇，
申请(专利权)人：合肥中科易康达生物医学有限公司，
类型：发明
国别省市：