集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流控芯片及方法技术

本发明专利技术提供一种集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流控芯片，包括一个或多个反应单元，按照液体流向，所述反应单元依次包括进样腔、第一连接通道、反应腔、第二连接通道、检测腔；所述第二连接通道包括弯曲部，液体流经所述弯曲部的阻力大于液体流经第一连接通道的阻力。本发明专利技术通过在反应腔与检测腔中间加入弯曲部的第二连接通道，从而使第二连接通道的阻力大于第一连接通道，即液体经过第一连接通道所需的离心力小于第二连接通道，通过不同的离心力设定可保证在第一个阶段液体只进入反应腔，增大离心力可使反应腔内的液体进入检测腔，避免了样品在第一次离心时进入检测腔，影响后续检测反应。影响后续检测反应。影响后续检测反应。

【技术实现步骤摘要】
集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流控芯片及方法


[0001]本专利技术属于微流控芯片
，具体来说是一种集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流控芯片及其方法。

技术介绍

[0002]现场即时检测(Point of Care Test,POCT)对于预防和有效应对传染病爆发至关重要。而简单易用、多功能、高灵敏度且快速的核酸检测方法是POCT的关键。目前核酸检测的主要方法是通过聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)实现靶基因的扩增，后续再通过琼脂糖凝胶电泳实现结果可视化，或者可以通过荧光实时定量PCR在仪器上进行实时检测。PCR技术因灵敏度高、特异性好等优势，成为核酸检测的经典方法。但该技术依赖于精密的温控系统，设备价格高昂，反复升降温导致扩增时间较长，且需要专业的操作人员，无法很好得满足现场快速检测的需求。
[0003]规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)是细菌中一种适应性免疫系统，CRISPR
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Cas系统以其特异性高、可开发性强、简单、高效等特点，成为基因编辑领域发展最快、应用最广的技术。既为体内基因编辑技术带来革命性突破，也为体外诊断领域开拓了新的方向。基于CRISPR
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Cas系统的体外诊断技术在病原体核酸检测方面展示出良好性能，在肿瘤基因诊断、遗传病筛查、移植排斥反应检测等方面也具有很大潜力。将CRISPR
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Cas系统应用于核酸检测，在提高诊断结果的可靠性方面表现出超高的灵敏度和单碱基分辨率的特异性，同时兼具检测时间短、成本低、便携式设计的特点，开辟了新一代核酸POCT的应用场景，具有极大的市场潜力。
[0004]将CRISPR
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Cas系统与PCR或等温扩增技术相结合，在CRISPR检测前对目的片段进行扩增富集，可以显著提高检测灵敏度。但核酸扩增和CRISPR
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Cas体系是两个独立反应，即需先进行核酸扩增，然后再将扩增产物转移到CRISPR系统中进行靶基因检测。在转移过程中，由于存在扩增后开盖、产物转移、闭盖等操作，极易造成实验室气溶胶污染，导致检测结果假阳性，且在短时间内较难解决。另外，由于激活后的Cas酶具有非特异反式切割功能，可以无差别切割荧光报告分子，导致CRISPR
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Cas体系无法实现多靶标同时检测，该项不足限制了CRISPR
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Cas方法在多种病原体筛查中的应用。因此，迫切需要建立一种方法或研制一种装置，在扩增结束后，完成产物得自动化、全封闭转移；同时，又能实现多个靶基因的同时扩增与检测。
[0005]公布号为CN112695073A的专利技术申请公开了一种RPA
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CRISPR一步式核酸检测方法。所述核酸检测方法将待测溶液、RPA试剂混合放置在管底，将crRNA与Cas12a蛋白预装到注射器，在扩增反应后，通过推动注射器的活塞使得crRNA和Cas12a蛋白与反应混合物混合进行反应，再通过蓝光激发，得到检测结果。此方法通过注射器和离心管的结合将RPA反应和CRISPR反应整合到相对密闭的体系中，避免了核酸污染，具有一定的优越性。但是在操作过程中需要手动操作注射器，步骤繁琐且无法实现多个靶基因的同时检测。
[0006]微流控芯片作为最具发展潜力的新型分子诊断平台，将生物和化学等领域所涉及的样品制备、分离与检测等基本操作单元集成到一块几平方厘米的芯片上，具有样品用量少、分析时间短、高通量、灵敏度高、仪器小型化、污染小等优点。而离心式微流控芯片可以通过离心力来实现自动化进样，而且可以通过集成多个通道实现多个靶基因的同时扩增与检测。
[0007]公告号为CN205379906U的技术专利公开了一种多用途离心式微流控芯片，该芯片包括一条或者多条的波浪形主通道，每条主通道的一端与进样孔相连通，另一端与排气孔相连接，主通道的波谷处通过一连接管道与反应池相连接，在连接管道上设置缓存池。该芯片主要适合于一步法的等温扩增技术，即一阶段反应，核酸扩增和检测在一个腔体内进行，无法实现核酸扩增和CRISPR检测两阶段式反应。

技术实现思路

[0008]本专利技术所要解决的技术问题在于如何实现核酸扩增和CRISPR检测两阶段分离。
[0009]本专利技术通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
[0010]集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流控芯片，包括一个或多个反应单元，按照液体流向，所述反应单元依次包括进样腔、第一连接通道、反应腔、第二连接通道、检测腔；所述第二连接通道包括弯曲部，液体流经所述弯曲部的阻力大于液体流经第一连接通道的阻力。
[0011]本专利技术通过在反应腔与检测腔中间加入弯曲部的第二连接通道，从而使第二连接通道的阻力大于第一连接通道，即液体经过第一连接通道所需的离心力小于第二连接通道，通过不同的离心力设定可保证在第一个阶段液体只进入反应腔，增大离心力可使反应腔内的液体进入检测腔，避免了样品在第一次离心时进入检测腔，影响后续检测反应。
[0012]进一步的，在第一离心力作用下，液体通过第一连接通道进入反应腔，并停留在反应腔，在第二离心力作用下液体从反应腔穿过第二连接通道进入检测腔，所述第一离心力小于第二离心力。
[0013]进一步的，所述弯曲部自第二连接通道的起始端开始。
[0014]进一步的，所述第一连接通道为直管。
[0015]进一步的，所述弯曲部为直角转弯的蛇形通道。
[0016]进一步的，在所述检测腔的上游还设置有缓冲腔。
[0017]进一步的，多个所述反应单元以微流控芯片的转动中心为圆心放射性均匀布置，多个所述反应单元的进样腔首尾连通，其中第一个反应单元的进样腔进口和最后一个反应单元的进样腔出口为样品进出口。
[0018]进一步的，相邻两个进样腔之间的连接通道为窄颈结构。
[0019]进一步的，所述反应单元除第二连接通道外为呈轴对称结构。
[0020]本专利技术还提供上述微流控芯片的使用方法，包括以下步骤：
[0021]将待测的核酸样本加入所述反应单元的进样腔后，启动离心机开始第一阶段的离心，使样品从进样腔进入反应腔，进行核酸扩增程序；在核酸扩增结束后，进行第二阶段离心，使反应腔内的液体进入检测腔，在检测腔内进行核酸检测程序，其中第一阶段的离心转速小于第二阶段的离心转速。
[0022]本专利技术的优点在于：
[0023]本专利技术通过在反应腔与检测腔中间加入弯曲部的第二连接通道，且弯折程度大于第一连接通道，从而使第二连接通道的阻力大于第一连接通道，即液体经过第一连接通道所需的离心力小于第二连接通道，通过不同的离心力设定可保证在第一个阶段液体只进入反应腔，增大离心力可使反应腔内的液体进入检测腔，避免了样品在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流控芯片，其特征在于，包括一个或多个反应单元，按照液体流向，所述反应单元依次包括进样腔、第一连接通道、反应腔、第二连接通道、检测腔；所述第二连接通道包括弯曲部，液体流经所述弯曲部的阻力大于液体流经第一连接通道的阻力。2.根据权利要求1所述的集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流控芯片，其特征在于，在第一离心力作用下，液体通过第一连接通道进入反应腔，并停留在反应腔，在第二离心力作用下液体从反应腔穿过第二连接通道进入检测腔，所述第一离心力小于第二离心力。3.根据权利要求1或2所述的集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流控芯片，其特征在于，所述弯曲部自第二连接通道的起始端开始。4.根据权利要求1或2所述的集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流控芯片，其特征在于，所述第一连接通道为直管。5.根据权利要求1或2所述的集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流控芯片，其特征在于，所述弯曲部为直角转弯的蛇形通道。6.根据权利要求1或2所述的集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流控芯片...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱灿灿，朱灵，李亚楠，杨柯，洪承刚，胡安中，邓国庆，刘勇，
申请(专利权)人：合肥中科易康达生物医学有限公司，
类型：发明
国别省市：