一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白‑表皮细胞生长因子融合蛋白的层析方法。具体步骤为1)从重组人血清白蛋白‑表皮生长因子融合蛋白基因工程水稻种子中提取含有重组人血清白蛋白‑表皮生长因子融合的粗提液；2)将含有人血清白蛋白‑表皮细胞生长因子融合蛋白的粗提液经阳离子交换层析，得到初级产物Ⅰ；3)将初级产物Ⅰ经阴离子交换层析，得到纯化的人血清白蛋白‑表皮细胞生长因子融合蛋白的目标物。本发明专利技术的提取纯化方法可获得纯度大于95％的重组人血清白蛋白‑表皮细胞生长因子融合蛋白，蛋白活性好，产量高。且本发明专利技术的工艺简单，经济高效，适宜工业生产应用。

【技术实现步骤摘要】
一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的方法。
技术介绍
人表皮细胞生长因子(humanepidermalgrowthfactor，hEGF)是一种含53个氨基酸的单链多肽，通过与受体细胞上的受体结合，能够广泛刺激多种细胞如表皮细胞，成纤维细胞，内皮细胞以及平滑肌细胞的增殖，分化和迁移，从而起到加速组织的再生和修复的作用。近年来，hEGF在临床方面应用广泛，如促进皮肤创伤，割伤，烧伤，烫伤以及口腔溃疡，胃溃疡和十二指肠的愈合。在高端化妆品市场，同样存在巨大需求。目前hEGF制备主要有人源性提取，化学合成和外源表达，能满足工业化生产的大多来自于外源表达，例如重组毕赤酵母分泌表量达到300～900mg/L发酵液(US5102798,CN1210145A)，重组短小芽孢杆菌分泌表达产率能达到1～3g/L的发酵液(SHOGOEBISU,1996)，尽管在目前的
内hEGF的表达量已经提升本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的层析方法，依次包括以下步骤：/n1)将含有重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的转基因水稻种子脱壳磨碎后加入提取液得到提取混合物；提取液组分为5～20mM磷酸盐，5～20mM醋酸钠，10～30mM硫酸铵，10～20mM辛酸钠，1～5mM还原型谷胱甘肽，pH6.0～8.0；将所述提取混合物的pH调节至4.5～5.9，搅拌酸沉后过滤得到含重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的粗提液；/n2)将粗提液经阳离子交换层析得到初级产物Ⅰ；/n3)将初级产物Ⅰ经阴离子交换层析得到纯化的重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的层析方法，依次包括以下步骤：
1)将含有重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的转基因水稻种子脱壳磨碎后加入提取液得到提取混合物；提取液组分为5～20mM磷酸盐，5～20mM醋酸钠，10～30mM硫酸铵，10～20mM辛酸钠，1～5mM还原型谷胱甘肽，pH6.0～8.0；将所述提取混合物的pH调节至4.5～5.9，搅拌酸沉后过滤得到含重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的粗提液；
2)将粗提液经阳离子交换层析得到初级产物Ⅰ；
3)将初级产物Ⅰ经阴离子交换层析得到纯化的重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)的方法为：
2a)将所述转基因水稻种子脱壳成半精米，并磨碎至细度为80～100目的米粉，将所述米粉与提取液按照比例为1：5～1：10(kg/L)混合得到提取混合物，提取时间为1～2h，提取温度为25～60℃；
2b)将所述提取混合物的pH用乙酸调整为4.5～5.9进行酸沉，酸沉时间为1～8h，酸沉温度为4℃～30℃，酸沉方式为慢速搅拌；
2c)将2b)步骤的提取混合物酸沉后离心或用2～5％重量的珍珠岩进行压滤后，经0.22～0.45μm滤膜微滤得到含重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的粗提液。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述提取液组分为10mM磷酸盐，10mM醋酸钠，20mM硫酸铵，20mM辛酸钠，2mM还原型谷胱甘肽，pH为7.5；米粉与提取液的比例为1：5(kg/L)，提取时间为1.5h，提取温度为55～60℃。


4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述提取混合物酸沉的pH为4.5，酸沉时间为4h，酸沉方式为慢速搅拌。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中阳离子交换层析填料为CaptoMMC或BestaroseDiamondMMC。


6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中阴离子交换层析填料选自QBestaroseFastFlow、QBestaroseHP、BestaroseDEAE、QSepharoseTMHP、QSepharoseTMFastFlow和DEAESepharoseTMFastFlow。


7.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于所述阳离子交换层析填料为CaptoMMC或BestaroseDiamondMMC，层析步骤为：
7a)使用平衡缓冲液以50-200cm/h的流速平衡层析柱，所述平衡缓冲液组分为20～50mMNaAc，0～40mMNaCl，1～5mM还原型谷胱甘肽，1～5mMEDTA-2Na，pH为4.5～5.5，电导为5～10mS/cm；
7b)以步骤1)中的粗提液为上样样品，其电导为5～10mS/cm，pH为4.5～5.5，上样流速为100～170cm/h；
7c)使用7a)的缓冲液8～10倍柱体积再平衡层析柱，使用3～5倍柱体积的洗杂缓冲液I以100～170cm/h的流速洗脱杂蛋白，所述洗杂缓冲液I的组分为20～50mMNaAc，10％～15％(V/V)异丙醇，pH为4.5～5.5；
7d)使用20～25倍柱体积的洗杂缓冲液II以100～170cm/h的流速再次洗脱杂蛋白,所述洗杂缓冲液II组分为20～50mMNaAc，10％～15％(V/V)异丙醇，1.2～1.88MNaCl，pH为4.5～5.5；
7e)使用洗脱缓冲液以100～170cm/h的流速洗脱目标蛋白，所述洗脱缓冲液的组分为20～50mM磷酸盐，0.4～0.5MNaCl，1～5mM还原型谷胱甘肽，1～5mMEDTA-2Na，pH为6.0～6.5，所得洗脱液即为初级产物I。


8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述阳离子交换层析条件为：
8a)使用平衡缓冲液以50-200cm/h的流速平衡层析柱，平衡缓冲液组分为20mMNaAc，34...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨代常，欧吉权，邓贝，
申请(专利权)人：武汉禾元生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42