检测大环内酯类化合物的代谢物的方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了检测大环内酯类化合物的代谢物的方法和试剂盒，其中，检测大环内酯类化合物的代谢物的方法包括：将待测样品进行提取处理和净化处理，以便得到待测液；利用超高效液相色谱与四极杆静电场轨道阱傅里叶转换联用质谱联用系统(UHPLC‑Q‑Exactive‑Orbitrap质谱联用系统)进行检测，以便对所述大环内酯代谢物进行定性分析和/或定量分析。该方法采用超高效液相色谱与四极杆静电场轨道阱傅里叶转换联用质谱联用系统进行检测，灵敏度和回收率及重现性高，可用于食品等物质中大环内酯类代谢物残留含量的准确测定。

【技术实现步骤摘要】
检测大环内酯类化合物的代谢物的方法和试剂盒
本专利技术涉及分析化学领域，具体地，涉及检测大环内酯类化合物的代谢物的方法和试剂盒。
技术介绍
大环内酯类是链霉菌产生的广谱抗生素，主要用于临床和动物的细菌感染。但是，滥用或不合理添加会产生多种毒副作用，例如：消化道症状，肝毒性，过敏，心脏毒性，心律不齐和尖锐湿疣。这些化合物很容易在动物体内积累。而且，容易通过食物链传播到人体内，会对消费者构成威胁。如今，食品中的大环内酯类抗生素已成为食品安全研究的主要关注点。目前，有报道首次在生活和工业废水中发现3种代谢物，其浓度高达20.1μg/L，可能间接污染农作物和食品。包括了N-去甲基罗霉素，N-去甲基克拉霉素，红霉素A肟。这3种代谢物因与母体药物结构相似，因此也有一些毒性和生态毒理作用。到目前为止，尚未开发出研究食品中这3种代谢物的残留测定方法。虽然这3种新兴的代谢产物在农产品和食品中的药物浓度较低，但毒性显着。同时，再加上基质的复杂性，样品纯化方法和高灵敏度仪器分析方法具有极大的挑战性。因此，有必要开发一种方法来研究这3种化合物的可能的迁移残留，以有效控制食品中抗生素的迁移。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种检测大环内酯类化合物的代谢物的方法，操作简单、灵敏度和回收率及重现性高，该方法尤其适用于3种新兴的大环内酯类化合物(红霉素、克拉霉素和罗红霉素)的代谢产物。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种检测大环内酯类化合物的代谢物的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：将待测样品进行提取处理和净化处理，以便得到待测液；利用超高效液相色谱与四极杆静电场轨道阱傅里叶转换联用质谱联用系统(UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap质谱联用系统)进行检测，以便对所述大环内酯类代谢物进行定性分析和/或定量分析。其中，本文所用术语“大环内酯类化合物的代谢物”是指大环内酯类抗生素化合物在在体内多种药物代谢酶(尤其肝药酶)的作用下，化学结构发生改变，继而在体内生物转化成为有药理活性的代谢物或产生有毒的代谢物，例如，红霉素A肟、N-去甲基克拉霉素和N-去甲基罗红霉素这三种代谢物是红霉素、克拉霉素和罗红霉素三种大环内酯类化合物的代谢物。根据本专利技术实施例的检测大环内酯类化合物的代谢物的方法，采用超高效液相色谱与四极杆静电场轨道阱傅里叶转换联用质谱联用系统进行检测，对大环内酯类化合物的代谢物均有良好的检测效果，灵敏度和回收率及重现性高，分析速度快，溶剂使用量少，成本低，操作简便，样品制备过程中使用的装置简单，尤其适用于食品等物质中大环内酯类化合物代谢物残留含量的准确测定。根据本专利技术的实施例，该待测样品为食品，例如牛奶等复杂基质样品。对于复杂基质的样品，专利技术人发现，通过提取处理和净化处理，利用吸附剂与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化，能快速简单的去除复杂基质对于待测化合物检测的干扰，简化样品处理程序，提高检测的灵敏度和准确性。根据本专利技术的实施例，所述提取处理包括：将所述待测样品与提取剂混合，以便得到第一混合物；将所述第一混合物进行超声处理，以便得到第二混合物；将所述第二混合物进行离心处理，以便得到第一上清液。由此，有利于提高检测的灵敏性和回收率。根据本专利技术的实施例，所述净化处理包括：将所述第一上清液与净化剂混合，以便得到第三混合物；将所述第三混合物进行超声处理，以便得到第四混合物；将所述第四混合物进行静置分离，以便得到第二上清液；将所述第二上清液进行干燥过滤，以便得到所述待测液。由此，有利于提高检测的灵敏性和回收率。根据本专利技术的实施例，所述提取剂为0.05％-0.1％甲酸-乙腈、无水硫酸镁和氯化钠的混合物。其中，0.05％-0.1％甲酸-乙腈可以快速沉淀牛奶样品中的蛋白质，硫酸镁可除去牛奶中的大部分水分，氯化钠可将牛奶中残留的水分与乙腈溶液分层。三者共同作为提取剂时，可对样品中目标物进行快速提取，减少提取的时间。同时试剂价格均比较低廉。根据本专利技术的实施例，基于10mL0.05％-0.1％(v/v)甲酸-乙腈，含有300-500mg无水硫酸镁和1-3g氯化钠。由此，利用该比例的提取剂进行提取，提取效果好，速度快。根据本专利技术的实施例，所述净化剂为乙酸钠、N-丙基乙二胺和C18的混合物。专利技术人对多种净化剂进行筛选，研究发现，对于大环内酯类代谢物，乙酸钠、N-丙基乙二胺和C18的纯化效果和回收率更佳，有利于提高检测的灵敏度、准确性和回收率。根据本专利技术的实施例，乙酸钠、N-丙基乙二胺和C18的质量比为10-20∶1∶1-4。三种吸附剂材料的用量如上时，样品基质效应可明显降低，能有效去除杂质且不对目标物有吸附，同时三种吸附剂的用量相对最少，对目标物的回收率较高。根据本专利技术的实施例，所述超高效液相色谱的色谱条件包括：色谱柱：C18色谱柱，规格为2.1×100mm，3.5μm；进样温度：30℃；样品温度：10℃；进样量：5.0μL；流量：0.2mL/min。由此，色谱的分离效果好，检测的精确度和灵敏度高。根据本专利技术的实施例，所述质谱的质谱条件包括：离子源：HESI源；毛细管温度：350℃；雾电压：3.6KV；鞘气：40psi；辅助气体：10arb；加热器温度：350℃；质谱检测方式：Full-ms和dd-ms2。其中，一级质谱分辨率为70000，二级质谱扫描分辨率为35000。同时，Full-ms可对样品中的目标物进行全扫描，找出HESI源电离条件下目标物的离子化模式，确定母离子的扫描质量数，而dd-ms2对目标物的质荷比进行进一步的电离，选出其中5个质谱响应最高的子离子，同时质谱分辨率较高，可减少相近质量数的离子的相互干扰，本专利技术一些实施例的检测结果可见表1根据本专利技术的实施例，所述色谱的洗脱剂为A：0.05％～0.15％甲酸-水(10mmol/L乙酸铵)，B：乙腈。由此，分析时间短，色谱峰形好，分辨率高。待测物的电离效率，显著提高检测的灵敏度。由此，大环内酯类抗生素的代谢物，在10-15min之内可得到分离，峰形相对较好，有利于目标物的定性和定量分析。结果见图2.根据本专利技术的实施例，所述色谱的洗脱条件为：10％B，0-1分钟；10％-98％B，1-15分钟；98％B，15-20分钟；98％-10％B，20-21分钟；10％B，21-25分钟。由此，大环内酯类代谢物分离效果好，检测时间适宜。根据本专利技术的实施例，所述代谢物包括：红霉素A肟、N-去甲基克拉霉素、N-去甲基罗红霉素，这三种代谢物是红霉素、克拉霉素和罗红霉素三种大环内酯类化合物的代谢物。根据本专利技术的另一方面，本专利技术提供了一种用于前述检测大环内酯类化合物的代谢物的方法的试剂盒。根据本专利技术的实施例，该试剂盒包括：第一提取剂：0.05％-0.1％甲酸-乙腈；第二提取剂：无水硫酸镁；第三提取剂：氯化钠；第一净化剂：乙酸钠；第二净化剂：N-丙基乙二胺；第三净化剂：C18；色谱柱：C18色谱柱，规格为2.1×100mm，3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测大环内酯类化合物的代谢物的方法，其特征在于，包括：/n将待测样品进行提取处理和净化处理，以便得到待测液；/n利用超高效液相色谱与四极杆静电场轨道阱傅里叶转换联用质谱联用系统进行检测，以便对所述大环内酯类代谢物进行定性分析和/或定量分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测大环内酯类化合物的代谢物的方法，其特征在于，包括：
将待测样品进行提取处理和净化处理，以便得到待测液；
利用超高效液相色谱与四极杆静电场轨道阱傅里叶转换联用质谱联用系统进行检测，以便对所述大环内酯类代谢物进行定性分析和/或定量分析。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取处理包括：
将所述待测样品与提取剂混合，以便得到第一混合物；
将所述第一混合物进行超声处理，以便得到第二混合物；
将所述第二混合物进行离心处理，以便得到第一上清液。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述净化处理包括：
将所述第一上清液与净化剂混合，以便得到第三混合物；
将所述第三混合物进行超声处理，以便得到第四混合物；
将所述第四混合物进行静置分离，以便得到第二上清液；
将所述第二上清液进行干燥过滤，以便得到所述待测液。


4.根据权利要2所述的方法，其特征在于，所述提取剂为0.05％-0.1％甲酸-乙腈、无水硫酸镁和氯化钠的混合物，
任选地，基于10mL0.05％-0.15％甲酸-乙腈，含有300-500mg无水硫酸镁和1-3g氯化钠。


5.根据权利要2所述的方法，其特征在于，所述净化剂为乙酸钠、N-丙基乙二胺和C18的混合物，
任选地，乙酸钠、N-丙基乙二胺和C18的质量比为(10-20)∶1∶(1-4)。


6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的色谱条件包括：
色谱柱：C18色谱柱，规格为2.1×...

【专利技术属性】
技术研发人员：张峰，凌云，王佳，姚美伊，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11