检测绿原酸类化合物方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了检测绿原酸类化合物方法和试剂盒，其中，检测绿原酸类化合物的方法包括：将待测样品进行提取处理，以便得到待测液；以及利用液相色谱‑四极杆/静电场轨道阱质谱联用系统对所述待测液进行检测，以便对所述绿原酸类化合物进行定性分析和/或定量分析。该检测方法简单快速，准确性和灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
检测绿原酸类化合物方法和试剂盒
本专利技术涉及分析化学领域，具体地，涉及检测绿原酸类化合物方法和试剂盒，更具体地，涉及检测绿原酸类化合物的方法和试剂盒，以及判断待测化合物是否为绿原酸类化合物的方法。
技术介绍
目前，临床中对绿原酸的功效成分研究已经有大量报导，但是研究还大多针对的是对从山银花和金银花中获得的已知的几种含量较高的绿原酸类化合物的研究，而对于绿原酸类化合物特别是新型绿原酸类天然产物的发现，目前还缺乏较好的分析方法。由此，检测绿原酸类化合物的方法有待改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种检测绿原酸类化合物的方法，该方法检测过程简单快速，准确性和灵敏度高，尤其适于药食同源产品中绿原酸类化合物的检测。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种检测绿原酸类化合物的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：将待测样品进行提取处理，以便得到待测液；以及利用液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱联用系统对所述待测液进行检测，以便对所述绿原酸类化合物进行定性分析和/或定量分析。本专利技术中所用术语“绿原酸类化合物”(chlorogenicacid，CGA)：是指由咖啡酸(Caffeicacid)与奎尼酸(Quinicacid，1-羟基六氢没食子酸)生成的缩酚酸一类天然酚类化合物。目前已有商业化的绿原酸类化合物标准品主要包括(3-咖啡酰奎尼酸(3-caffeoylquinicacid，3-CQA)、4-咖啡酰奎尼酸(4-CQA)、5-咖啡酰奎尼酸(5-CQA)、3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid3,4-diCQA)、3，5-二咖啡酰奎尼酸(3,5-diCQA)、4，5-二咖啡酰奎尼酸(4,5-diCQA)等，但尚有很多绿原酸类化合物无法获得标准品。如图1所示，奎尼酸C3、C4和C5等多个位点均可以结合咖啡酸，此外，还有些类似咖啡酸的结构也可以和奎尼酸结合，因此，绿原酸类化合物有很多种。根据本专利技术实施例的检测绿原酸类化合物的方法，利用液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱联用系统对待测液进行检测，能够精确测定化合物分子离子质量数和或碎片离子质量数，检测结果偏差小，根据其精确分子离子质量数和保留时间对样品中的绿原酸类化合物的含量进行精准定量，根据本专利技术的一些实施例，无需使用标准品即可对待测样品中所有绿原酸类化合物进行精准定性分析，检测过程简单快速，准确性和灵敏度高。另外，根据本专利技术上述实施例的检测绿原酸类化合物的方法还可以具有如下附加的技术特征：根据本专利技术的实施例，所述待测样品为药食同源产品，也就是说，既是食品又是药品的物品。在这里泛指能够作为药品、保健品及食品等中药材产品。根据本专利技术的实施例，所述检测的流动相的有机相为甲醇，无机相为0.08-0.12体积％甲酸/水溶液。专利技术人研究发现，流动相中有机相为甲醇时比乙腈等有机试剂有更好的分离度,甲酸/水溶液体系比仅仅水溶液有更好的灵敏度。根据本专利技术的实施例，所述检测的洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱的条件为：0-2.0min为5％A,2.0-20.0min流动相由5％A增加到80％A；流速：0.3mL/min。由此，该洗脱条件有利于将不同结构的化合物进行分离。根据本专利技术的实施例，所述液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱联用系统的色谱条件：固定相：HypersilGoldaQcolumn色谱柱，所述色谱柱的规格为2.1×100mm,1.9μm；进样体积：5μL；流速：0.3mL/min。由此，对于绿原酸类化合物分离度和峰型均较好，从而使分析灵敏度和精确度更高。根据本专利技术的实施例，所述液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱联用系统的质谱离子源条件：电离源：加热电喷雾离子源(HESI)；电离模式：负离子模式；喷雾电压:2.5kV；毛细管温度：325℃；加热器温度：350℃；鞘气：50Arb；辅助气：10Arb；扫描模式：一级离子全扫描/所有一级离子全碎裂+一级离子全扫描/数据依赖的二级碎片离子扫描(FullMS/AIF+FullMS/dd-MS2)。由此，在该色谱和质谱条件下，检测得到的峰形更好，检测的灵敏度和稳定性更高，在常见浓度范围内有较好的线性关系和较高的回收率。根据本专利技术的实施例，所述FullMS/AIF的质谱检测条件：一级全扫描分辨率：70000FWHM；采集范围：m/z200～1200；C-trap最大容量(AGCtarget):3×106；C-trap最大注入时间:200ms；所有离子全碎裂(AIF)分辨率：17500FWHM；采集范围：m/z80～1200；C-trap最大容量(AGCtarget)：1×105；C-trap最大注入时间:50ms；归一化碰撞能量(NCE):35。专利技术人利用上述FullMS/AIF的质谱检测条件进行分析，数据采集完成后对AIF的数据进行精确碎片离子提取，分别提取m/z173.0450，m/z191.0556和m/z353.0873三个碎片离子，并设定每个提取离子的m/z偏差小于5ppm,可以得到整个色谱图上所有包含这些特征碎片离子的色谱峰的保留时间(见图2)，并根据FullMS的数据结果，获得碎片离子色谱峰所对应的化合物的精确分子离子质量数。由此，通过FullMS/AIF，在该检测条件下，有利于样品中可能存在的绿原酸类化合物能充分被检测识别，同时采集的一级分子离子色谱信息有利于帮助将识别出的潜在的绿原酸类化合物的实测分子离子质量数与理论分子离子质量数进行比对，从而可以排除一些干扰物质。根据本专利技术的实施例，所述FullMS/dd-MS2模式下质谱条件：一级全扫描分辨率：70000FWHM；采集范围：m/z200～1200；C-trap最大容量(AGCtarget):3×106；C-trap最大注入时间:200ms；数据依赖二级子离子扫描(dd-MS2)分辨率：17500FWHM；采集范围：80～1200m/z；C-trap最大容量(AGCtarget):1×105；C-trap最大注入时间:50ms；归一化碰撞能量(NCE):35。由此，在该检测条件下，可以将上一步识别出的绿原酸类化合物通过二级碎片离子谱的测定，进行进一步的确认，从而可以进一步排除一些干扰物质，提高检测的准确度。利用上述FullMS/dd-MS2的检测条件，专利技术人基于对试剂盒中6种绿原酸类化合物标准品的碎片离子谱分析(详见附表1)，得到了绿原酸类化合物的特征碎片离子。专利技术人发现对于只有一个咖啡酸取代的绿原酸类化合物，其中均存在着m/z179.0344±5ppm，m/z191.0556±5ppm，m/z173.0450±5ppm三个标识性碎片离子，其中m/z179.0344±5ppm是咖啡酰基的特征碎片离子，m/z191.0556±5ppm，m/z173.0450±5ppm两个碎片离子分别代表奎尼酸基以及奎尼酸基脱去一分子水后的残留基团，对于这三个标识性碎片离子所代表的结构可参考附录图4，而对于双咖啡酸取代的绿原酸类化合物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测绿原酸类化合物的方法，其特征在于，包括：/n将待测样品进行提取处理，以便得到待测液；以及/n利用液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱联用系统对所述待测液进行检测，以便对所述绿原酸类化合物进行定性分析和/或定量分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测绿原酸类化合物的方法，其特征在于，包括：
将待测样品进行提取处理，以便得到待测液；以及
利用液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱联用系统对所述待测液进行检测，以便对所述绿原酸类化合物进行定性分析和/或定量分析。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测的流动相：A：甲醇，B：0.08-0.12体积％甲酸/水溶液，
任性地，所述检测的洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱的条件为：0-2.0min为5％A，2.0-20.0min流动相由5％A增加到80％A；流速：0.3mL/min。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱联用系统的色谱条件：
固定相：HypersilGoldaQcolumn色谱柱，所述色谱柱的规格为2.1×100mm,1.9μm；
进样体积：5μL；
流速：0.3mL/min。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱联用系统的质谱离子源条件：
电离源：加热电喷雾离子源；
电离模式：负离子模式；
喷雾电压:2.5kV；
毛细管温度：325℃；
加热器温度：350℃；
鞘气：50Arb；
辅助气：10Arb；
扫描模式：一级离子全扫描/所有一级离子全碎裂+一级离子全扫描/数据依赖的二级碎片离子扫描。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述一级离子全扫描/所有一级离子全碎裂的质谱检测条件：
一级全扫描分辨率：70000FWHM；
采集范围：m/z200～1200；
C-trap最大容量:3×106；
C-trap最大注入时间:200ms；
所有离子全碎裂分辨率：17500FWHM；
采集范围：m/z80～1200；
C-trap最大容量:1×105；
C-trap最大注入时间:50ms；
归一化碰撞能量:35。


6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述一级离子全扫描/数据依赖的二级碎片离子扫描...

【专利技术属性】
技术研发人员：张峰，冯峰，陈赵然，段晓毅，徐美霞，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11