包含修饰的GlcNAc-1-磷酸转移酶的组合物及其使用方法技术

本公开提供一种修饰的UDP‑GlcNAc:溶酶体酶GlcNAc‑1‑磷酸转移酶，其具有增强的磷酸化溶酶体酶的能力；及其使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含修饰的GlcNAc-1-磷酸转移酶的组合物及其使用方法政府权利本专利技术是根据国立卫生研究院(NIH)授予的CA008759在政府支持下完成的。政府对本专利技术享有某些权利。相关申请的交叉引用本申请要求2016年9月30日提交的美国临时申请号62/402,468的权益，其公开内容特此通过引用整体并入。
本公开提供一种修饰的UDP-GlcNAc:溶酶体酶GlcNAc-1-磷酸转移酶，其具有增强的磷酸化溶酶体酶的能力；及其使用方法。
技术介绍
酶替代疗法(ERT)目前是许多溶酶体贮积病的主要治疗形式，尽管其功效因个体病症而异。大多数这些遗传性病症起因于单个溶酶体酶缺乏活性，这导致通常被酶降解的物质的积累。溶酶体中储存物质的累积最终导致细胞和器官功能障碍。ERT的目标是将足够量的正常酶引入缺陷细胞的溶酶体中以清除储存物质并恢复溶酶体功能。这种形式的疗法首先用于1型戈谢病患者，他们缺乏酸性β-葡糖脑苷脂酶活性，并且主要在巨噬细胞型细胞中积累葡萄糖神经酰胺。含有具有末端甘露糖残基的N-连接聚糖的替代酶通过静脉内输注并经细胞表面甘露糖受体被巨噬细胞摄取。然后将内吞的酶通过内体转运至溶酶体，在所述溶酶体中，其在此病症中具有良好的临床效果。由于大多数细胞类型缺乏甘露糖受体，用于治疗涉及巨噬细胞以外的细胞类型的溶酶体贮积症的替代酶利用与细胞表面的甘露糖6-磷酸(Man-6-P)受体的结合，用于随后递送至溶酶体。这些酶是从哺乳动物细胞(大多数是中国仓鼠卵巢细胞)的分泌物中纯化出来的，其进行工程化可产生高水平的感兴趣的酶。此方法取决于内源性GlcNAc-1-磷酸转移酶磷酸化表达的溶酶体酶的N-聚糖的甘露糖残基的能力。通过此技术产生的一些替代酶是高度磷酸化的并且与Man-6-P受体良好结合。然而，其他的磷酸化程度很低，限制了它们在ERT中的有效性。这包括蓬佩病酶(酸性α-葡糖苷酶，GAA)和α-甘露糖苷贮积症酶(溶酶体酸性α-甘露糖苷酶，LAMAN)。因此，本领域需要酶替代疗法和改进的酶产生的改进方法。
技术实现思路
一方面，本公开提供一种修饰的GlcNAc-1-磷酸转移酶(GlcNAc-1-PT)α/β亚基，其参考SEQIDNO:1的全长人类GlcNAc-1-PTα/β亚基包含氨基酸的内部缺失。全长GlcNAc-1-PTα/β包含间隔区-1结构域(间隔区-1)、缺口1结构域(缺口1)、缺口2结构域(缺口2)、间隔区-2结构域(间隔区-2)、DNA甲基转移酶相关蛋白相互作用结构域(DMAP)、间隔区-3结构域(间隔区-3)、α/β亚基切割位点和间隔区-4结构域(间隔区-4)，从多肽的N-末端排列至C-末端。在修饰的GlcNAc-1-PTα/β亚基中，间隔区-1在内部缺失。另外，缺口-1与α/β亚基切割位点之间的区域也可缺失。另一方面，本公开提供一种包含修饰的GlcNAc-1-PTα/β亚基的多核苷酸的载体，其中间隔区-1或间隔区-1和缺口-1与α/β亚基切割位点之间的区域缺失。一方面，本公开提供一种宿主细胞，其包含载体，所述载体包含修饰的GlcNAc-1-PTα/β亚基的多核苷酸，其中间隔区-1或间隔区-1和缺口-1与α/β亚基切割位点之间的区域缺失。一方面，本公开提供一种通过在细胞中表达外源性GlcNAc-1-PTα/β亚基来增加感兴趣的蛋白质的寡糖磷酸化的方法，所述感兴趣的蛋白质诸如β-葡糖脑苷脂酶(GBA)、GalA、组织蛋白酶D(CathD)、C2型尼曼病蛋白(NPC2)、β-己糖胺酶(HEXB)、α-半乳糖苷酶(GLA)、β-甘露糖苷酶(MANBA)、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶B、酸性α-葡糖苷酶(GAA)或溶酶体酸性α-甘露糖苷酶(LAMAN)。一方面，本公开提供通过在细胞中表达修饰的GlcNAc-1-PTα/β亚基来增加感兴趣的蛋白质与细胞表面甘露糖6-磷酸(Man-6-P)受体(Man-6-P)的结合的方法。一方面，本公开提供通过在细胞中共表达修饰的GlcNAc-1-PTα/β与感兴趣的溶酶体酶来增强溶酶体酶的磷酸化的方法，所述感兴趣的溶酶体酶诸如GBA、GalA、CathD、NPC2、HEXB、GLA、MANBA、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶B、GAA或LAMAN。附图说明申请文件包含至少一幅以彩色绘制出的绘图。在提出请求并支付必要费用后，本事务所将提供具有一幅或多幅彩色绘图的本专利申请公布的副本。图1A、图1B、图1C、图1D、图1E、图1F和图1G描绘示意图、比对、免疫印迹和图表，其显示间隔区-1结构域调节α/β前体的切割位点。(图1A)GlcNAc-1-PTα/β亚基模块排列和用盘基网柄菌间隔区-1替换人类间隔区-1序列的示意图。(图1B)用抗V5抗体探测的GNPTAB-/-HeLa细胞中表达的WTα/β相对于DS1缺失突变体的免疫印迹分析。(图1C)使用用载体、WTα/β前体或各种突变体cDNA转染的GNPTAB-/-细胞的提取物，磷酸转移酶对单糖αMM的活性。将活性标准化为总蛋白质浓度。(图1D)用WTα/β前体或DS1突变体cDNA转染的GNPTAB-/-HeLa细胞的S1P活性的抑制。转染后24h，将PF-429242以10μΜ的最终浓度添加到细胞中，并将细胞再温育24h，然后收获。制备细胞提取物，并且通过SDS-PAGE分离20μg的每种裂解物，并经受蛋白质印迹。(图1E)两种GlcNAc-1-PTα亚基S1P底物位点与其他已知S1P位点的氨基酸比对。阴影框显示保守的共有切割基序。(图1F)在WTα/β或DS1缺失突变体的情况下点突变体R925A、R879A和R925A/R879A的免疫印迹分析。通过SDS-PAGE凝胶分离在GNPTAB-/-HeLa细胞中表达的蛋白质，转移到硝基纤维素并用抗V5抗体探测。(图1G)用WTα/β或图1F中所示的各种突变体转染GNPTAB-/-HeLa细胞以确定酶磷酸化，如通过三种内源性溶酶体酶与CI-MPR-亲和珠的结合所确定的。测定结合材料的活性，并且将用WTα/β转染的细胞获得的值设定为100％。图2A、图2B和图2C描绘图表和免疫印迹，其显示间隔区-1的缺失增强若干种非溶酶体糖蛋白的磷酸化。(图2A)通过用单独的载体、WTα/β前体或DS1突变体cDNA转染GNPTAB-/-HeLa细胞，接着进行[2-3H]甘露糖标记来确定总可溶性蛋白质的甘露糖磷酸化。将显示的值计算为用CI-MPR亲和珠回收的计数作为磷钨酸沉淀物中总计数的一部分的百分比。*表示p＝<0.05。(图2B)用编码3种溶酶体蛋白或4种非溶酶体蛋白的质粒以及WTα/β前体或DS1突变体cDNA共转染GNPTAB-/-HeLa细胞。用[2-3H]-甘露糖标记细胞，接着免疫沉淀分泌到培养基中的蛋白质并确定含有Man-6-P的N-聚糖百分比。将用WT获得的值设定为1.0。与WTα/β前体共表达的指定蛋白质的磷酸化的绝对值为：GLA，36±3％；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种修饰的GlcNAc-1-磷酸转移酶(GlcNAc-1-PT)α/β亚基，其参考具有SEQ ID NO:1的序列的全长人类GlcNAc-1-PTα/β亚基包含氨基酸的内部缺失，其中SEQ ID NO:1从N末端至C末端包含间隔区-1结构域(间隔区-1)、缺口1结构域(缺口1)、缺口2结构域(缺口2)、间隔区-2结构域、DNA甲基转移酶相关蛋白相互作用结构域(DMAP)、间隔区-3结构域(间隔区-3)、α/β亚基切割位点和间隔区-4结构域(间隔区-4)，其中所述间隔区-1在内部缺失。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20160930 US 62/4024681.一种修饰的GlcNAc-1-磷酸转移酶(GlcNAc-1-PT)α/β亚基，其参考具有SEQIDNO:1的序列的全长人类GlcNAc-1-PTα/β亚基包含氨基酸的内部缺失，其中SEQIDNO:1从N末端至C末端包含间隔区-1结构域(间隔区-1)、缺口1结构域(缺口1)、缺口2结构域(缺口2)、间隔区-2结构域、DNA甲基转移酶相关蛋白相互作用结构域(DMAP)、间隔区-3结构域(间隔区-3)、α/β亚基切割位点和间隔区-4结构域(间隔区-4)，其中所述间隔区-1在内部缺失。


2.如权利要求1所述的修饰的GlcNAc-1-PTα/β亚基，其中参考SEQIDNO:1，氨基酸86至氨基酸322之间的氨基酸缺失。


3.如权利要求1所述的修饰的GlcNAc-1-PTα/β亚基，其中缺口1与所述α/β切割位点之间的区域缺失。


4.如权利要求1所述的修饰的GlcNAc-1-PTα/β亚基，其中参考SEQIDNO:1，氨基酸438与氨基酸928之间的氨基酸缺失。


5.如权利要求1所述的修饰的GlcNAc-1-PTα/β亚基，其中间隔区-1缺失，并且缺口1与所述α/β切割位点之间的区域缺失。


6.如权利要求1所述的修饰的GlcNAc-1-PTα/β亚基，其中参考SEQIDNO:1，氨基酸86至氨基酸322之间的氨基酸缺失，并且氨基酸438与氨基酸928之间的氨基酸缺失。


7.如权利要求4至6所述的修饰的GlcNAc-1-PTα/β亚基，其中参考SEQIDNO:1，缺口1与所述α/β切割位点之间的缺失不延伸超过氨基酸928。


8.一种载体，其包含如权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸。


9.一种宿主细胞，其包含如权利要求8所述的载体。


10.如权利要求9所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。


11.如权利要求9所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。


12.如权利要求9至11中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞经工程化以产生高水平的感兴趣的蛋白质。


13.如权利要求12所述的宿主细胞，其中所述感兴趣的蛋白质是溶酶体蛋白。


14.如权利要求13所述的宿主细胞，其中所述溶酶体蛋白选自由以下组成的组：β-葡糖脑苷脂酶(GBA)、GalA、组织蛋白酶D(CathD)、C2型尼曼病蛋白(NPC2)、β-己糖胺酶(HEXB)、α-半乳糖苷酶(GLA)、β-甘露糖苷酶(MANBA)、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶B、酸性α-葡糖苷酶(GAA)和溶酶体酸性α-甘露糖苷酶(LAMAN)。


15.如权利要求12所述的宿主细胞，其中所述感兴趣的蛋白质是非溶酶体蛋白。


16.如权利要求15所述的宿主细胞，其中所述非溶酶体蛋白选自由以下组成的组：DNA酶1、肾素、白血病抑制因子(LIF)、蛋白O-岩藻糖基转移酶2(PoFUT2)、糖胃蛋白酶原(GP)和冯维勒布兰德因子A1A2A3结构域。


17.如权利要求13所述的宿主细胞，其中所述感兴趣的蛋白质选自由以下组成的组：蓬佩病酶(酸性α-葡糖苷酶，GAA)和α-甘露糖苷贮积症酶(溶酶体酸性α-甘露糖苷酶，LAMAN)。


18.一种增加感兴趣的蛋白质的寡糖磷酸化的方法，所述方法包括在细胞中表达外源性修饰的GlcNAc-1-PTα/β亚基。


19.一种增加感兴趣的蛋白质与细胞表面甘露糖6-磷酸受体(Man-6-P)结合的方法，所述方法包括在细胞中表达修饰的GlcNAc-1-PTα/β亚基。


20.如权利要求18或19所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：S科恩菲尔德，柳林，W李，B多雷，
申请(专利权)人：华盛顿大学，
类型：发明
国别省市：美国;US