【技术实现步骤摘要】
一种优化的扩增目标核酸的聚合酶、复合体系及应用
本专利技术涉及生物
，更具体地说，涉及一种优化的扩增并纯化目标核酸的方法和体系。
技术介绍
对于靶向扩增技术而言，扩增纯化后得到产量和纯度都足够的目标产物非常关键。现有技术对于核酸扩增后目标产物的纯化方式主要包括固相载体吸附法，比如吸附柱法或固相可逆磁珠法，利用的是载体对核酸本身较强的亲和力和吸附力；分子筛法，通过分子量大小的不同来筛选目标分子；电泳法，通过电泳分析，将目标分子量的核酸纯化回收；亲和纯化，用标记物标记探针或引物，利用固相载体通过标记物的亲和性来纯化目标DNA分子。鉴于通量和成本，目前在二代测序建库中常用的是基于标记物与固相载体亲和性状的亲和纯化，比如用链霉亲和素包被的磁珠纯化用生物素标记的探针或引物扩增得到的扩增产物。该法相较其它三种纯化法而言，对于短片段或单链DNA回收率高，原始DNA模板转化率高，纯化产物中非核酸产物少，且适合不定长度的原始模板，但缺点是纯化产物中未结合模板的带有标记分子的游离探针或引物大量残留。为了解决被标记的游离探针...
【技术保护点】
1.具有高掺入率的dNTP-DNA聚合酶复合体系，其特征在于，所述高掺入率的dNTP-DNA聚合酶复合体系包括dNTP和DNA聚合酶；/n所述dNTP是至少部分经标记分子修饰的dNTP，当DNA聚合酶含N端结构域的定点突变时，所述经标记分子修饰的dNTP中的修饰基团与dNTP碱基基团连接的前3个C原子内含有或不含有阻止修饰基团分子旋转的二键或三键结构；当DNA聚合酶不含N端结构域的定点突变时，所述经标记分子修饰的dNTP中的修饰基团与dNTP碱基基团连接的前3个C原子内不含有阻止修饰基团分子旋转的二键或三键结构；/n所述DNA聚合酶是具有3’-5’外切酶活性的高保真聚合酶。/n
【技术特征摘要】
1.具有高掺入率的dNTP-DNA聚合酶复合体系，其特征在于，所述高掺入率的dNTP-DNA聚合酶复合体系包括dNTP和DNA聚合酶；
所述dNTP是至少部分经标记分子修饰的dNTP，当DNA聚合酶含N端结构域的定点突变时，所述经标记分子修饰的dNTP中的修饰基团与dNTP碱基基团连接的前3个C原子内含有或不含有阻止修饰基团分子旋转的二键或三键结构；当DNA聚合酶不含N端结构域的定点突变时，所述经标记分子修饰的dNTP中的修饰基团与dNTP碱基基团连接的前3个C原子内不含有阻止修饰基团分子旋转的二键或三键结构；
所述DNA聚合酶是具有3’-5’外切酶活性的高保真聚合酶。
2.如权利要求1所述的复合体系，其特征在于，
所述DNA聚合酶是Pfu，DeepVent，KOD中的一种或多种；和/或，
所述DNA聚合酶由Pfu，DeepVent，KOD中的一种或多种经过改造得到；
所述经标记分子修饰的dNTP是dATP，dCTP，dGTP中的一种或多种；当DNA聚合酶含V93Q突变时，所述经标记分子修饰的dNTP中的修饰基团与dNTP碱基基团连接的前3个C原子内含有或不含有阻止修饰基团分子旋转的二键或三键结构；当DNA聚合酶不含V93Q突变时，所述经标记分子修饰的dNTP中的修饰基团与dNTP碱基基团连接的前3个C原子内不含有阻止修饰基团分子旋转的二键或三键结构；
所述标记分子是生物素。
3.如权利要求2所述的复合体系，其特征在于，
所述含有生物素的修饰基团与所述dATP结合的位点是碱基的N6或7-Deaza；
优选的，当所述含有生物素的修饰基团与所述dATP结合的位点是碱基的N6时，所述经生物素修饰的dATP是biotin-7-dATP，或biotin-14-dATP，其结构式如下所示；
当所述含有生物素的修饰基团与所述dATP结合的位点是碱基的7-Deaza时，
所述经生物素修饰的dATP是biotin-11-dATP，其结构式如下所示；
和/或，所述含有生物素的修饰基团与所述dCTP结合的位点是碱基的N4或C5；
优选的，当所述含有生物素的修饰基团与所述dCTP结合的位点是碱基的N4时，所述经生物素修饰的dCTP是biotin-14-dCTP，其结构式如下所示；
当所述含有生物素的修饰基团与所述dCTP结合的位点是碱基的C5时，所述经生物素修饰的dCTP是biotin-11-dCTP或biotin-16-dCTP，其结构式如下所示；
和/或，所述含有生物素的修饰基团与所述dGTP结合的位点是碱基...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨国华，郭志伟，林国旻，车彬，余佳佳，李杰，
申请(专利权)人：南京君华基因科技有限公司，上海羿鸣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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